HPLC法同时测定夏枯草中熊果酸和齐墩果酸含量

申 琳，运乃茹

(天津中医药大学第二附属医院,天津 300150)

药品质量与检验

HPLC法同时测定夏枯草中熊果酸和齐墩果酸含量

申 琳，运乃茹*

(天津中医药大学第二附属医院,天津 300150)

目的:建立高效液相色谱(HPLC)法同时测定夏枯草中熊果酸和齐墩果酸含量。方法：色谱柱 Thermo BDS Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-甲醇-0.5%乙酸铵(55∶15∶30)；流速0.8 ml/min；检测波长210 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。结果：熊果酸进样量在31.81～795.2 μg/ml范围内，峰面积与进样量之间线性关系良好(r=0.999 8)，平均回收率为97.88%；齐墩果酸进样量在33.81～845.2 μg/ml范围内，峰面积与进样量之间线性关系良好(r=0.999 9)，平均回收率为98.39%。结论：本方法可使齐墩果酸、熊果酸得到基线分离，同时测定夏枯草中熊果酸和齐墩果酸的含量。实验结果准确，灵敏度及重复性好，分离度高，为夏枯草的质量控制与评价提供了有效的手段。

夏枯草，熊果酸，齐墩果酸，高效液相色谱法

夏枯草是唇形科夏枯草PrunellavulgarisLinn的干燥果穗[1]，为多年生草本，始载于《神农本草经》，因“夏至后即枯”得名，别名棒槌草、铁色草、大头花、夏枯头等。夏枯草辛、苦，寒，入肝、胆经，功效清肝、散结、利尿，用于目赤肿痛、乳痈肿痛、瘰疬瘿瘤等[2]。夏枯草主要含有三萜及其苷类、甾醇、香豆素、糖类等多种成分。现代药理学研究表明[3,4]，夏枯草具有降压、降糖、抗菌、特异性免疫抑制等作用。由于其重要的药用价值及广泛的药理作用，日益引起关注。

熊果酸和齐墩果酸与夏枯草抗炎、免疫抑制作用相关，《中国药典》(2005年版)中收录测定夏枯草中熊果酸含量的HPLC法，但在实际应用中，常常因为齐墩果酸具有相似结构而干扰，使色谱分离度达不到要求，影响熊果酸的实际测定值，使夏枯草质量评价结果存在偏差。本实验使二者达到良好的分离效果，也为多指标控制夏枯草质量提供依据。除此之外，本研究还优化了《中国药典》中收录的样品前处理方法，使其更为快捷简便[5-11]。

1 仪器和试剂

高效液相色谱仪[Waters Alliance 2695，包括Empower 3工作站、自动进样器、四元梯度泵、柱温箱、二极管阵列检测器(PDA)]；电子天平(塞多利斯BS 210S)；超声波仪(HENGGAO T&D，HU3120B)。甲醇(色谱纯，天津市康科德科技有限公司，批号121125)；乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司，批号120924)；乙酸铵(分析纯，天津市化学试剂一厂，批号20111102)；熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110742-200517)；齐墩果酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110729-200505)；夏枯草药材(亳州市中药饮片厂，批号140901401,150101401,150301401，水分含量10%)；0.5%乙酸铵溶液(称取乙酸铵0.5 g加水稀释至100 ml)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Thermo BDS Hypersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-甲醇-0.5%乙酸铵(55∶15∶30)；流速0.8 ml/min；检测波长210 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μl；采用外标法对峰面积进行定量。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取熊果酸对照品19.88 mg和齐墩果酸对照品21.13 mg，置于同一25 ml量瓶中，加适量无水乙醇，超声溶解，放冷，加无水乙醇定容，摇匀，即得对照品溶液。其中熊果酸和齐墩果酸浓度分别为 0.795 2和0.845 2 mg/ml。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取夏枯草粉末(2号筛)2.0 g，置100 ml三角瓶中，加入乙醇40 ml超声40 min，过滤，滤渣用乙醇洗涤三次，洗涤液合并于滤液中，旋蒸回收溶剂，加入无水乙醇溶解残渣并转移至25 ml量瓶中，定容，过0.45 μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μl，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，见图1。

1.熊果酸 2.齐墩果酸

2.3 线性关系考查 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液10、20、30、40、50和60 μl，分别注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分别测定熊果酸和齐墩果酸色谱峰面积。以对照品溶液的浓度对峰面积回归，制定标准曲线，计算回归方程，确定线性范围。熊果酸回归方程为Y=2.846 0X-2.751 9(r=0.999 8)，表明熊果酸在31.81～795.2 μg/ml范围内线性关系良好；齐墩果酸回归方程为Y=2.912 3X-1.826 8(r=0.999 9)，浓度在33.81～845.2 μg/ml范围内线性关系良好。

2.4 精密度考查 取同一熊果酸和齐墩果酸混合对照品溶液(浓度分别为0.159 0和0.169 1 mg/ml)，按照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，熊果酸和齐墩果酸峰面积的RSD值分别为0.34%和0.24%，结果表明该方法精密度良好。

2.5 稳定性考查 取同一供试品溶液(140901401)，按照“2.1”项下色谱条件，分别在0、1、2、4、8、12、16、24和32 h进样，测定峰面积，熊果酸和齐墩果酸峰面积RSD值分别为0.58%和1.59%。结果表明供试品溶液在32 h内稳定。

2.6 重现性考查 取同一样品(140901401)6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算熊果酸和齐墩果酸的含量，RSD值分别为1.03%和1.39%。结果表明方法重现性良好。

2.7 加样回收率试验 精密称取6份夏枯草药材粉末(140901401)各1 g，准确加入熊果酸和齐墩果酸对照品各适量，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算含量及加样回收率。熊果酸和齐墩果酸的平均加样回收率分别为 97.88%和98.39%，RSD分别为1.41%和1.83%。结果表明，熊果酸和齐墩果酸回收率符合要求，测定方法可行。结果见表1和表2。

表1 熊果酸加样回收率试验结果

表2 齐墩果酸加样回收率试验结果

2.8 样品测定 精密称取3批次夏枯草药材粉末2.0 g各3份，按照上述方法测定。夏枯草中熊果酸平均含量为0.243%，RSD为1.43%；齐墩果酸平均含量为0.074%，RSD为2.80%。结果见表3。

表3 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 含量测定指标成分的选择 夏枯草广泛的药理作用日益受到关注。熊果酸是《中国药典》(2005版)中夏枯草的法定质控成分[12]，而另一成分齐墩果酸由于具有与熊果酸相似的化学结构和药理活性，且在药材中含量较高，因而在实际应用中，两者的色谱分离度达不到要求，影响熊果酸的实际测定值，使夏枯草质量评价结果存在偏差。本试验探求出将齐墩果酸和熊果酸分离度提高的方式，有利于实际工作中二者的含量测定，为进一步控制夏枯草质量、提高临床疗效提供了基础工作支持，因而具有实际意义。

3.2 供试品溶液制备方法的选择 《中国药典》(2005版)中收录的供试品制备方法较为烦琐耗时，并使用了大量的有毒溶剂。本试验从提取溶剂、提取方法和提取时间三方面进行了优化：①提取溶剂：对乙醇、无水乙醇、乙醚和甲醇4种溶剂的提取效率进行比较，结果4种溶剂提取率相近；由于乙醇的毒性低，故选乙醇作提取溶剂，且对熊果酸与齐墩果酸测定无干扰，基线较平稳。②提取方法：对比索氏、加热回流和超声3种提取方法，提取率相近，考虑到试验的快捷、简便，故采用超声作为提取方法。③提取时间：对样品溶液超声提取时间(25、35、40和45 min)进行考查，结果超声25 min的提取率较低，40和45 min的提取率一样，因而选择40 min为提取时间。

3.3 检测方法的选择 熊果酸和齐墩果酸系同分异构体，化学结构接近，较难分离。采用紫外检测器检测时，波长选择非常重要。检测波长太低，溶剂系统的截止波长接近检测波长，造成基线噪音大，平衡基线所需时间长，流动相的本底吸收高，易影响组分检测；检测波长太高，二者吸收值太低，响应因子小，同样影响组分检测。熊果酸和齐墩果酸的无水乙醇溶液在205 nm波长处有最大吸收，但在此波长下，流动相甲醇末端吸收较严重，基线不够理想，因而选择210 nm为检测波长，结果效果良好。

由于熊果酸和齐墩果酸的结构相近，试验发现流动相的组成、比例以及流速的变化对两种酸的保留时间和峰形影响较大。选用甲醇-水作为流动相时，两者的保留时间接近，无法使其分开。继而考查了其他种类和比例的流动相，结果表明乙腈-甲醇-0.5%乙酸铵(55∶15∶30)，能使熊果酸与齐墩果酸达到良好分离。

本研究建立了同时测定夏枯草中熊果酸和齐墩果酸含量的方法，结果准确可靠，且具有分离效果好、灵敏度高、准确性好等优点，为夏枯草的质量评价提供了良好的方法和依据。

1 中国药典[S].一部.2010:263

2 国家中医药管理局.中华本草[M].上海: 上海科技出版社,1988:1642

3 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科技出版社,1977:1827

4 熊斌,雷志勇,陈虹.熊果酸药理学的进展[M].国外医学·药学分册,2004,6(31):133

5 钟辉.不同产地白花蛇舌草中熊果酸和齐墩果酸的含量测定[J].中医药学报,2010,38(2):105-108

6 张京京,李钦,陈海莉,等.不同产地和品种柿叶中熊果酸和齐墩果酸的含量测定[J].时珍国医国药,2015,26(1):33-35

7 刘伟,崔永霞,陈志红,等. HPCE 测定不同产地夏枯草中齐墩果酸、熊果酸、迷迭香酸含量[J].中医学报，2011,26(159):964-966

8 刘茂军,韩锋,高静,等.HPLC 法测定乳痈消痛片中熊果酸[J].现代药物与临床,2013,28(5):727-729

9 刘炜,吴义忠.健胃消食片中熊果酸的含量测定[J].中国现代药物应用,2010,4(1):5-7

10 李刚,蔡德富,刘吉成.HPLC法测定夏枯草中熊果酸的含量[J].齐齐哈尔医学院院报，2011,32(5):760-761

11 郑单萍.高效液相色谱法测定夏枯草中熊果酸的含量[J].海峡药学,2012,24(9):72-74

12 中国药典[S].一部.2005:197

Simultaneous determination of ursolic acid and oleanolic acid in Prunella Vulgaris Linn by HPLC

Shen Lin，Yun Nairu

(The Second Hospital Attached to Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300150)

Objective: To establish a quantitative HPLC method for simultaneous determination of ursolic acid and oleanolic acid inPrunellaVulgarisLinn. Method: The separation was performed on a Thermo BDS Hypersil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase consisted of acetonitrile-methanol-water-0.5% ammonium acetate water solution (55∶15∶30) and the flow rate was 0.8 ml/min. The detection wavelength was at 210 nm. The column temperature was 30 ℃. Results: The linear ranges of ursolic acid and oleanolic acid were 31.81～795.2 μg/ml and 33.81～845.2 μg/ml, respectively. The average recoveries of ursolic acid and oleanolic acid were 97.88% and 98.39%, respectively. Conclusion: The method can be used for quality control ofPrunellaVulgarisLinn, with a good sensitivity, resolution，accuracy and reproducibility.

PrunellaVulgarisLinn,ursolic acid,oleanolic acid,HPLC

2015-10-15

R927.2

A

1006-5687(2016)02-0001-03

*通讯作者：运乃茹，E-mail：59368539@qq.com。