Notch细胞信号通路在神经干细胞增殖分化中的作用

刘 浩 赵 燕 张念平 张 晓 张 琳

(济南市第三人民医院重症医学科，山东 济南 250032)

Notch细胞信号通路在神经干细胞增殖分化中的作用

刘 浩 赵 燕 张念平1张 晓 张 琳2

(济南市第三人民医院重症医学科，山东 济南 250032)

Notch；神经干细胞；增殖分化

Notch是相邻细胞之间互相通讯的典型信号通路，其作用具有多样性，在调控细胞增殖、分化、凋亡和细胞周期等方面都发挥了重要作用。神经干细胞(NSCs)的增殖分化受诸多因素影响，越来越多的证据表明Notch细胞信号通路在此过程中具有重要作用。本文主要就Notch信号通路及其对NSCs增殖分化的作用进行综述。

1 Notch细胞信号通路的组成

Notch细胞信号通路主要由Notch受体、配体(DSL)、CSL蛋白和下游靶基因组成。典型的Notch信号通路激活大致过程为：Notch受体与配体DSL结合，释放出的Notch胞内结构域(NICD)进入细胞核与CSL蛋白结合，激活下游靶基因。以上为CSL依赖性通路，此外Notch蛋白还可以通过非CSL依赖性通路发挥作用。与典型的Notch信号通路的主要区别在于，非典型Notch信号通路由非典型的配体引发，不需要Notch受体的裂解，也无需CSL参与，如Deltex依赖性通路等〔1〕。

Notch受体表达在细胞表面，主要由胞外区、跨膜区和胞内区3部分构成。胞外区是结合配体的区域，由数目不定的(一般29～36个)表皮生长因子样重复序列(EGF-R)和3 个富含半胱氨酸的Lin-12-Notch重复序列(LNR)组成，其中第11、12 个EGF-R 重复序列介导与配体的相互作用〔2〕。在跨膜区甘氨酸-1743和缬氨酸-1744之间有一个裂解位点(S3位点)。此位点经相关蛋白酶的水解作用，Notch在S3位点发生断裂，生成胞内区NICD和一个短的跨膜片段。Notch受体胞内区包含1个重组信号结合蛋白-Jk相关分子RAM(RBP)-J结构域、6～7个锚蛋白重复序列(ANK)、1 个负调节蛋白稳定性的PEST 结构域〔富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)〕。另外Notch 1～3受体还含有2 个核定位信号(NLS)，而Notch4受体只有1个NLS。核定位信号能使Notch受体胞内域到达细胞核内，进而胞内域上的转录激活区(TAD)启动下游事件，值得指出的是Notch3、Notch4不含有TAD结构域〔3〕。胞内区可将Notch 信号传递到细胞核内，其中RAM结构域是与CSL结合的区域，PEST结构域与Notch受体的降解有关。

果蝇中只有一个Notch 受体，哺乳动物中有4 个Notch 同源受体：Notch1、2、3和4。Notch蛋白合成后发挥作用前需要经过3次切割。第一次是在高尔基体内被Furin转化酶裂解为2个片段：Nothc蛋白胞外区(ECN)和Notch蛋白跨膜区(NTM)，两者随后通过钙依赖性非共价键结合形成异二聚体，被转移到细胞膜上。当配体与Notch蛋白胞外域结合后，Notch蛋白又发生两次蛋白水解，首先是被肿瘤坏死因子-α-转化酶(TACE)酶解，然后γ-促分泌酶催化第二次分裂，最后这一过程需要早老蛋白(PS)参与。经历3次酶切的Notch蛋白释放出NICD进入胞质，并被转移到细胞核内，在转录辅助因子CoA及其他因子的参与下与CSL结合，继而调节其下游的靶基因〔4〕。DSL也是一种跨膜蛋白，包含细胞内和细胞外结构域,其特点是胞外区包含数量不等的EGF-R重复序列和DSL结构域(富含半胱氨酸，是配体与Notch蛋白相互作用的位点)。Notch配体表达于Notch受体所在细胞的邻近细胞上，能激活邻近细胞表面的Notch受体，进而调节附近细胞的增殖分化。在果蝇体内Notch配体有两种：Delta和Serrate配体。线虫体内的Notch配体为：Lag-2配体。故Notch配体又称DSL蛋白〔5〕。哺乳动物有5种Notch同源配体：其中与Delta 同源的称为Delta 样配体(包括Delta-like-1、Delta-like-3、Delta-like-4，即DⅡ-1、DⅡ-3、DⅡ-4)；与Serrate 同源的称为Jagged-1 和Jagged-2配体(JAG-1、JAG-2)〔6,7〕。

CSL是一组DNA结合蛋白，在哺乳动物中叫作CBF1(又叫RBP-Jκ)，在果蝇中叫作Su(H)，在线虫中叫作Lag-1，取首字母缩写为CSL〔8〕。此蛋白在Notch信号通路中起关键作用，它识别并结合Notch诱导基因启动子上特定的DNA序列(GTGGGAA)。以哺乳动物为例，在没有NICD的情况下，RBP-Jκ通过募集阻遏复合物蛋白(SHARP)形成共抑制复合物抑制Notch下游基因的转录。SHARP由辅抑因子甲维酸(SMRT)蛋白和组蛋白去乙酰相关阻遏蛋白(HDAC)-1组蛋白脱乙酰酶组成，它作为一个作用平台招募C-末端结合蛋白-相互作用蛋白(CtIP)和其他辅阻遏物及组蛋白修饰酶，与RBP-Jκ共同阻止下游基因的表达。当有NICD存在的情况下，NICD和RBP-Jκ结合，并招募辅激活物如主导控制样蛋白(MAML)-1和其他一些染色质修饰转录因子，进而启动Notch靶基因的转录〔9〕。CSL蛋白是Notch信号通路中关键的转录调节因子，此为经典的Notch信号通路又称为CSL依赖途径。

Notch信号的靶基因主要是碱性螺旋-环-螺旋基因(bHLH)，如哺乳动物中的发状分裂相关增强子(HES)、果蝇中的E(sp1)，非洲爪蟾中的Xhey-1。bHLH 基因包括促进神经发生基因(促进型)和抑制神经发生基因(抑制型)两类。促进神经发生基因包括神经分化发育相关基因Mash-1、Math、Ngn1/2、Neuro D。抑制神经发生基因有HES-1、HES-3 和HES-5及HES相关蛋白基因(HERP)〔10〕。此外有文章指出Notch信号还可作用于周期依赖性蛋白激酶、原癌基因c-myc及细胞周期蛋白等。上述这些基因中，以HES和Hey作为Notch信号通路靶基因的观点最为人们广泛接受。研究〔11〕表明胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、脑脂质结合蛋白(BLBP)、SOX2及p53等都是Notch信号通路的下游靶点。然而这些研究是基于体外基因水平及细胞层面上的探讨，至于生物体内受NICD/RBP-Jκ复合物调控的全部的下游靶基因，仍然是一个未知数〔11〕。

2 Notch信号通路影响NSCs的增殖分化

NSCs是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,给予一定的诱导条件,能分化成神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。很多研究〔12～19〕表明Notch信号通路调控NSCs的增殖分化。Notch受体和DSL表达于相邻的细胞膜上,当某一细胞DSL表达升高后，就会与邻近细胞表面的Notch受体结合，进而激活Notch细胞信号通路,从而阻止邻近的细胞向同一方向分化，这就是所谓的“旁侧抑制”作用。

在发育过程中，Notch信号通路决定了细胞的命运，同时在维持NSCs的特性方面也起重要作用。Notch1、Presenilins 和RBP是Notch信号通路的关键组成部分，在Notch1-/-、Presenilins-/-或RBP-Jκ-/- 的胚胎老鼠脑内，NSCs被完全耗尽。Notch下游靶基因Hes1、Hes5的失活，会导致脑发育过程中神经元过早的分化。以Presenilins缺陷的老鼠为实验对象，发现Notch信号通路能维持NSCs特性的稳定，此作用与老鼠的鼠龄、NSCs在脑内的位置无关〔12〕。研究〔13〕发现HES家族的DPN蛋白是果蝇NSCs维持自我更新能力的必要充分条件。DPN蛋白的减少会导致NSCs过早减少，这一过程可能是由同源异形盒蛋白Pros介导。相反，过表达DPN蛋白能使细胞提高并保持自我更新能力。另外，过表达Notch引起果蝇Ⅱ型NSCs和神经祖细胞增殖，而DPN蛋白的减少并没有抑制其增殖。这提示DPN蛋白和Notch在调控Ⅱ型NSCs的增殖中的作用相互独立〔13〕。

目前普遍的认识是激活Notch信号通路会抑制NSCs向神经元的分化，相反当阻断Notch细胞信号通路后，可促进向神经元分化。Notch信号通路对NSCs向胶质细胞分化的调节却有截然不同的效果，即Notch信号通路的激活促进NSCs向星型胶质细胞的分化,抑制NSCs向少突胶质细胞的分化。在神经发生过程中，新生的神经元分泌Notch配体(如Jagged 1、Delta-like 1)来激活其他NSCs的Notch信号通路。此时，Notch通路的激活是星形胶质细胞分化的充分必要条件。NSCs表达的NICD会导致GFAP启动子的脱甲基化，使GFAP表达。Notch是通过其下游靶基因NF1A对GFAP启动子起作用的，NF1A是一种转录因子，它诱导GFAP启动子上DNA甲基转移酶(DNMT)1的释放，从而使星形胶质细胞相关基因表达。由于Notch通路能有效地诱导星形胶质细胞的分化，它的作用也被严格调控着。NF1A可以通过抑制Hes1来限制Notch通路发挥作用，这个负反馈回路能防止过多地产生星形胶质细胞〔14〕。

不同的bHLH基因具有不同的功能，并按时空顺序表达于细胞分化的不同阶段。当促进型bHLH 基因表达上调时，不仅可以促使神经元的生成，而且可以诱导Notch 配体的表达，这些配体可以活化邻近细胞的Notch 信号通路，上调其HES-1、HES-3 和HES-5的表达，从而保持邻近细胞的未分化状态，维持NSCs的稳定和增殖〔15〕。抑制型bHLH 基因表达时，部分NSCs的分化被抑制，在晚些时候分化为胶质细胞，从而保持神经元和神经胶质细胞合适的数目和比例。当抑制型bHLH基因缺失时，NSCs过早地分化为神经元，导致NSCs消耗殆尽，神经胶质细胞数目减少〔16〕。此外，抑制型bHLH 基因可对促进型bHLH 基因进行抑制，如Hes1和Hes5的转录和表达,能对Mash-1、Math、Ngn1等进行抑制，阻止NSCs的分化〔17〕。抑制型bHLH基因和促进型bHLH基因相互协调，共同调节NSCs的分化，这能维持正常的神经细胞数目。

γ-促分泌酶是Notch信号通路中的一个重要组成部分。N-〔N-(3，5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰〕-2-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)是γ-促分泌酶的抑制剂，可以阻止NICD的释放，从而使Notch信号不能发挥正常的作用。Borghese等〔18〕认为Notch能维持胚胎干细胞来源的NSCs的自我更新能力，抑制细胞分化，而DAPT介导的Notch信号通路抑制，可以延迟DNA合成前期(G1)向DNA合成期(S)的过渡，并使胚胎干细胞来源的NSCs分化。最近的研究也发现，诱导多能干细胞(iPSCs)经DAPT处理后能加速向NSCs分化。于iPSCs培养的第22天，对巢蛋白、β-Ⅲ微管蛋白、GFAP等各种细胞标记物进行检测。定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析和免疫荧光分析均证实这些细胞标记物的表达上调。实验表明阻断Notch信号通路，可促使iPSCs向NSCs分化，最终形成星形胶质细胞和神经元。研究还指出，在iPSCs向NSCs分化过程中，Notch信号通路上的相关分子表达降低，而有些miRNA表达却增加了。因此，在iPSCs分化过程中，Notch信号通路可能是在miRNA的调控下发挥作用〔19〕。

另外，Notch信号通路还能与Numb蛋白一起，共同对NSCs的分裂起调控作用。Numb蛋白能决定多细胞生物细胞的不对称分裂，它可能通过作用于Notch的胞内域来发挥拮抗Notch信号通路的作用。Notch受到Numb蛋白的拮抗，能使NSCs向神经元分化。当无Numb蛋白对Notch拮抗，则使干细胞处于未分化的状态。Numb蛋白介导不对称分裂，因此当Numb蛋白功能缺失时，NSCs将发生对称分裂，即分裂为两个相同的NSCs，在分裂的过程中不会产生神经元〔20〕。

综上，NSCs在体外可以诱导分化为不同类型的细胞，如多巴胺能神经元、运动神经元等，可以通过移植分化成熟的神经细胞治疗各类中枢神经系统疾病。NSCs的分化过程非常复杂，受多种诱导因子和细胞信号通路的调控。NSCs定向分化的机制仍然不清楚，不能准确控制每个NSCs按预想的途径分化，这在一定程度上限制了NSCs的应用，需要在NSCs分化机制上进行深入的研究。

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〔2015-12-29修回〕

(编辑 苑云杰/王一涵)

张念平(1984-)，男，博士，主要从事老年病研究。

刘 浩(1974-)，男，硕士，副主任医师，主要从事重症医学临床与基础研究。

R34

A

1005-9202(2017)01-0247-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.107

1 广州医科大学 2 山东大学齐鲁医院