嵌合抗原受体修饰T细胞在肿瘤免疫治疗中的策略①

鲁大鹏 叶园园 王保龙

(安徽医科大学附属省立医院检验科，合肥230000)

嵌合抗原受体修饰T细胞在肿瘤免疫治疗中的策略①

鲁大鹏 叶园园 王保龙

(安徽医科大学附属省立医院检验科，合肥230000)

手术、化疗和放疗是治疗肿瘤的传统方法，但大部分情况下患者都不能获得理想的疗效。近年来，嵌合抗原受体修饰 T 细胞通过基因工程，赋予 T 细胞肿瘤靶向性、更强的杀伤活性和持久的生命力，并取得较好的临床疗效。然而，脱靶效应 、细胞因子风暴等毒性效应却极大地限制了CAR-T细胞技术的应用。本文就提高CAR-T细胞在治疗恶性肿瘤临床疗效方面进行如下综述。

1 CAR-T细胞的基本结构和发展历程

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)修饰T细胞是指基因修饰的人工改造体，被重新输入患者体内后提高效应T细胞识别肿瘤相关抗原(Tumour-associated antigen,TAA)的能力。CARs结构是由胞外抗原结合域(通常来自单链抗体可变区基因片段,single chain variable fragment,scFv)、铰链区、跨膜区和胞内区 (包括CD3-ζ链或FcεRIγ、共刺激分子信号域受体)构成。

1987 年，Kuwana等[1]首次提出CAR的概念并构建了可特异性识别肿瘤相关抗原的CAR-T细胞原型。第一代CAR信号域是CD3-ζ信号链，它能有效地促进T细胞活化和增强T细胞的细胞毒性[2]，但由于肿瘤细胞表面缺乏共刺激分子(第二信号)，CAR-T细胞不能持续性增殖，临床疗效有限。第二代CAR 信号域增加了1个共刺激分子如CD28，当CAR-T细胞识别肿瘤抗原后，胞内信号域和共刺激分子共同活化，促进IL-2合成，使T细胞的增殖、细胞毒性和持续性抗肿瘤能力等方面都有所提高[3]。为了进一步提高CAR-T细胞的免疫学效应，第三代CAR 信号域增加了2个共刺激分子，但实际临床试验中其效果是否更好尚未有确切的资料证明。第四代CAR(T cells redirected for universal cytokine killing,TRUCKs)是在第三代CAR的结构基础上，增加了一个或多个能够编码CAR及其启动子的载体。从而使得转基因产生的细胞因子能够结合免疫其他组件，促进机体固有免疫细胞杀伤不能被CAR识别的肿瘤细胞[4]。

2 影响CAR-T细胞免疫疗效的因素

2.1靶抗原的选择 “理想靶抗原”是指：①特异性在肿瘤细胞中表达而不存在正常组织中，主要是由于肿瘤细胞突变所致，是最理想的靶抗原。例如表皮生长因子受体Ⅲ突变型(EGFRvⅢ)是胶质母细胞瘤细胞突变的结果，在正常组织中没有发现[5]。②过表达于肿瘤组织而低表达于正常组织。肿瘤特异性靶抗原是极少的，因此我们需要根据靶抗原在正常组织和肿瘤组织中的不同表达水平和密度，平衡靶抗原和CAR-T细胞疗法毒性效应的利弊，选出最理想的 TAA，作为CAR-T细胞免疫治疗中的主要靶抗原。比如CD19是B细胞成熟过程的表面抗原，在大多数的B细胞恶性肿瘤表面都能表达，常用于淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病等[6,7]。

2.2效应T细胞的选择 效应T细胞是CAR表达生物学活性的主要加工厂，对CAR的抗肿瘤效应和持续时间至关重要，体外扩增前，对潜在的最理想的 T 细胞亚群进行精确检测和分离可提高CAR-T细胞免疫疗法的效果。在体外，效应记忆 T 细胞(Effector memory T cell,TEM)的细胞毒活性和增殖能力要优于中枢记忆 T 细胞 (Central memory T cell,TCM)，但在体内TCM不仅具有形成免疫记忆的潜能，还有更持久的抗肿瘤活性[8]。干细胞样记忆 T 细胞(Stem cell memory T cell,TSCM)具有持久的自我更新特性，因此TSCM具有高增殖和持续性存在的潜能。高表达CD62L、CD95和CCR-7的CD45RA+T细胞亚群中TSCM比TCM具有更有效的抗肿瘤活性和更久的存在时间[9]。

2.3共刺激分子的选择 CAR胞内信号区的共刺激分子在调节T细胞扩增、存在时间以及抗肿瘤效应等方面发挥着重要的作用，但不同的共刺激分子的生物学活性有所差别。常见的共刺激分子有CD28、肿瘤坏死因子超家族成员9 (4-1BB)、肿瘤坏死因子超家族成员4(OX40)、可诱导共刺激分子(ICOS)和CD27，其中CD28和4-1BB都能有效地促进IL-2和IFN-γ的分泌。研究表明4-1BB共刺激分子比CD28共刺激分子更适合CAR胞内信号区的构建[10]，因为4-1BB能有效地促进记忆T细胞的扩增和减少持续性CAR-T信号的耗尽，并且4-1BB信号似乎是CD8+记忆T细胞持续性存在的必需信号，而CD28促进初始T细胞扩增。一些研究却显示CD28和4-1BB的扩增和抗肿瘤效应没有明显的区别[11]。Hombach等[12]证明了CD28-CART细胞比CD28-OX40-CART细胞更有效，因为CD28-OX40共刺激分子可促进活化诱导细胞死亡(Activation-induced cell death,AICD)和减少抗肿瘤功能。某些研究却显示含有两个共刺激分子(如CD28和4-1BB)的CAR-T细胞比仅有单一共刺激分子的CAR-T细胞更有效地改善T细胞的存在时间和细胞毒性[11]。以上研究表明共刺激分子极大地影响CAR-T细胞疗法的效果，但最理想共刺激分子的种类和数量仍未确定，还需在体外和体内进一步的研究。

2.4肿瘤微环境的改变 肿瘤微环境的改变是实体瘤CAR-T细胞免疫治疗中最难克服的障碍，改变的肿瘤微环境通过多种调控机制抑制效应T细胞的浸润、激活和抗肿瘤功能，即使相当数量级的效应 T 细胞到达病灶，也无法发挥有效的杀伤作用。肿瘤微环境中的“免疫调节抑制剂”如程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)，通过与肿瘤细胞或基质细胞表面的PD-L1和PD-L2配体相互作用而降低效应T细胞的抗肿瘤活性[13]。调节性 T 细胞(Tregs) 和骨髓抑制细胞(MDSCs)在肿瘤微环境中起抑制作用，并且肿瘤细胞分泌的CCL22和CCL2细胞因子可分别诱导CCR4+Tregs 细胞[14]和CCR2+MDSCs[15]细胞聚集在肿瘤部位，最终使机体处于免疫耐受状态而降低效应T细胞的抗肿瘤作用。同时，肿瘤细胞分泌的转化生长因子-β(TGF-β)和IL-10也具有免疫抑制作用[16,17]，TGF-β可通过抑制CD8+效应T细胞和促进CD4+辅助T细胞转变为 Tregs细胞发挥免疫抑制作用。

3 增强CAR-T细胞免疫疗效的策略

3.1宿主淋巴细胞预清除 预处理中宿主淋巴细胞清除是CAR-T细胞治疗中必须进行的过程，直接影响最终的临床疗效，其作用机制为：①通过化疗(药物主要包括环磷酰胺、喷司他丁和苯达莫司汀)和/或靶向单克隆抗体(如利妥昔单抗)减少免疫抑制性T细胞数量(如Tregs细胞)，从而为体外输入的CAR-T细胞提供合适的体内微环境。②通过减少淋巴细胞对活化因子的影响，增加活化因子(如IL-7、IL-15)的累积，从而促进CAR-T细胞的增殖[18]。

3.2自杀基因 自杀基因是一种人工调控的“安全开关”，可特异性识别删除体内多余的CAR-T细胞。自杀基因是通过药物诱导激活而清除CAR-T细胞，如单纯疱疹病毒胸苷激酶 (Herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)基因、诱导凋亡相关基因caspase-9(iCaspase-9)和EGFRΔ基因。HSV-TK 的免疫原性较高，iCaspase-9和EGFRΔ基因是人源性蛋白，免疫原性低。自杀基因系统在临床试验中已成功去除CAR-T细胞，其中治疗效果最好的是他克莫司结合蛋白-12(FK506 binding protein-12,FKBP-12)与iCaspase-9结合形成的融合蛋白，这种融合蛋白被小分子二聚AP1903激活后，可导致T细胞的快速凋亡和清除[19]，同时FKBP-12 是一种诱导效率高 、特异性强的安全开关，故与iCaspase-9的结合治疗受到广泛使用。然而，自杀基因系统需要一段时间才能被激活，所以这些安全开关一般用于慢性毒性反应的治疗。

3.3阶梯式剂量方案 目前CAR-T细胞有效起始剂量的确定尚没有明确的指导方针，研究者多采用阶梯式剂量方案，它是指CAR-T细胞起始剂量由少至多，且不断监测患者的毒性效应，当可能出现严重毒性效应时立即停止。第二代和三代CAR-T细胞起始剂量应比第一代少，且给予淋巴细胞预清除的患者的CAR-T细胞起始剂量也比未经任何预处理的患者少。Morgan[20]小组和Ahmed[21]小组都用了HER2-CART进行过继性免疫治疗，最终Ahmed研究小组获得了更好的临床疗效和轻微的毒性效应，其中一个重要的原因是他们采取了阶梯式剂量方案，起始剂量 (1×104)CAR-T细胞/m2，逐级升高至(1 × 108)CAR-T细胞/m2，但Morgan小组直接单一高剂量(7.9 × 109) CAR-T细胞/m2。

3.4双特异性CAR-T细胞的治疗 双特异性CAR可分为三类：①简单双特异性CAR，指两种特异性的CAR共同修饰T细胞。例如，只有当效应T细胞同时表达针对前列腺癌的两种特异性靶抗原，前列腺特异性膜抗原(Prostate specific membrane antigen,PSMA)和蛋白错误折叠循环扩增(Protein misfolding cyclic amplification,PMCA)时，简单双特异性CAR-T细胞才能进行杀伤作用，正常细胞因不会同时存在PSMA和PMCA两种靶抗原而不被效应T细胞攻击[22]。②异质性CAR(inhibitory CAR，iCAR)，是基于调节正常T细胞信号的抑制性分子如 CTLA-4、PD-1、BTLA-4、LAG-3或各种各样的磷酸酶的CAR。iCAR 通常存在于正常细胞，低表达或者不存于肿瘤细胞，所以iCAR能选择性抑制正常细胞的细胞因子分泌、增殖和毒性扩散，iCAR和另一种特异性CAR共同修饰的效应T细胞只会引起肿瘤细胞的杀伤作用，而沉默保护正常细胞[23,24]。③串联性CAR(Tandem CAR,TanCAR)，是一种能同时识别细胞表面两种靶抗原的特异性CAR，因肿瘤细胞表面含有两种相关靶抗原，正常细胞不含有或者只含有一种相关靶抗原，进而TanCAR-T细胞只杀伤肿瘤细胞[25]。

3.5提高CAR-T细胞免疫疗效的持续性 自身免疫系统对CAR-T细胞外源肽的识别和破坏直接缩短了CAR-T细胞的存在时间，效应T细胞没有充足的时间杀伤肿瘤细胞而降低了抗肿瘤疗效。提高CAR-T细胞免疫疗效的持续性方案主要有两种：①通过耗尽机体内B细胞防止宿主对外源肽的免疫作用，进而保护CAR-T细胞。②多重受体与细胞因子受体，它们是Wilkie等[26]设计修饰T细胞的两种人造受体，一种受体可识别TAA，另一种受体为T细胞提供促进生长的细胞因子信号。如由T1E28z受体和细胞因子受体4αβ 共同修饰的CAR-T细胞作用时，T1E28z 可识别TAA，而细胞因子受体4αβ中的β 链亚单位与内源性IL-4 、IL-2 和 IL-15 共同结合，IL-4可诱导IL-2 和 IL-15炎性刺激信号，进而促进CAR-T细胞持续性作用[27]。

4 提高 CAR-T细胞免疫疗效的未来方向

4.1改善肿瘤免疫微环境 改善肿瘤免疫微环境可以极大地提高CAR-T细胞免疫疗效和降低预后的不良反应，但由于肿瘤微环境的复杂性和调控机制的多样性，单一疗法并不能取得有价值的临床疗效，基于肿瘤免疫微环境的主要调控机制，可以结合以下几点综合治疗：①阻断免疫抑制剂途径，大量数据证明加入PD-1免疫抑制途径的阻断剂(抗PD-1)后，CAR-T细胞疗效因PD-1与 PD-L1/PD-L2的相互作用被抑制而得到极大的提高[28]。②对于免疫抑制细胞，以Tregs细胞为例，CAR-T细胞结合特异性的共刺激分子(如CD28)可以降低Tregs细胞对肿瘤微环境的抑制作用[29]。另外，化疗和放疗可以通过诱导Tregs 细胞凋亡或特异性的去除Tregs而改善免疫抑制，一项研究中发现以低剂量的环磷酰胺为基础的化疗可有效清除 Tregs 细胞，达到免疫调节作用，联合使用其他免疫疗法可改善预后[30]。③细胞因子，TGF-β和IL-10是主要的免疫抑制因子，通过RNAi 技术等基因工程方法，下调 T 细胞表面 TGF-β 和IL-10受体表达,进而提高CAR-T细胞疗效。此外，IL-2、IL-12和IL-15 等活化因子可以促进效应T细胞的免疫作用，创造利于 T 细胞存活并发挥效能的微环境，通过诱导CAR-T 细胞分泌活化因子进而产生更有效的抗肿瘤作用[31-33]。

4.2CAR-T细胞外泌体的治疗 CAR-T细胞分泌的外泌体是一种直径为30～150 nm的膜性囊泡，外泌体中含有核酸、蛋白和脂类，是细胞间信息交流的重要载体[34]。CAR-T细胞外泌体治疗是CAR-T细胞免疫治疗的进一步发展，不仅具有CAR-T细胞高效的抗肿瘤效应，还能避免脱靶效应和细胞因子风暴等毒性效应。实体瘤由于肿瘤微环境的改变，降低了CAR-T细胞的活性而不能准确定位到肿瘤部位。外泌体是纳米级大小、且分布广泛，可通过各种生物性屏障如血脑屏障[35]。一旦分泌,它可扩散至邻近细胞或通过血液和其他体液准确定位到肿瘤部位。并且，外泌体包含的不同信息如microRNAs、mRNAs 和蛋白质，在细胞间传递时可以同时向多个细胞和多个部位传递信息[36]，使得外泌体作为“直接攻击物质”时可以迅速通过囊泡内容物识别靶细胞表面特异性受体广泛杀伤肿瘤细胞。此外，除了CAR-T细胞自身分泌的物质,还可以加入其他物质至CAR-T细胞外泌体中,避免肿瘤细胞产生耐药性。结合或交替使用 CAR-T细胞疗法和CAR-T细胞外泌体疗法也许会增强抗肿瘤效应。

4.3局部CAR-T细胞治疗 CAR-T细胞不能精确归巢到肿瘤部位(尤其是实体瘤)是影响其抗肿瘤疗效的一个主要原因，而在一些恶性肿瘤中，局部性疾病是影响癌症患者发生率和死亡率的主要原因，为此直接进行局部治疗比系统性治疗能取得更有效的结果。早期Adusumilli等[37]模仿人类胸膜恶性肿瘤构建一个原位模型，利用M28zCAR 修饰以间皮素为靶抗原的T细胞，并评估效应T细胞在两种途径中的疗效。他们发现，CAR-T细胞经胸膜腔内注射的疗效要远远超过经体液循环途径注射的疗效，并且只需后者 1/30的M28z T细胞剂量就能诱导长期的完全缓解。此外，胸腹腔内注射的CAR-T细胞可扩散至循环系统和胸腔外区域的特性使其也能用于转移性肿瘤的治疗，例如上皮卵巢癌和恶性胸膜间皮瘤，由于倾向于局部腹膜和胸膜腔内扩散应给予局部CAR-T细胞治疗[37]。

4.4CAR-NK细胞治疗 自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK) 是具有抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节功能的细胞，CAR-NK细胞免疫治疗也越来越多的用于临床试验。与CAR-T细胞治疗相比，它有三个优势：①CAR-NK细胞的半衰期较短，并且体外扩增的人源性NK细胞分泌的细胞因子谱包括γ干扰素、IL-3和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等，不同于CAR-T细胞分泌的TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12和IFN-α等炎症细胞因子，因此CAR-NK细胞输入不会引起细胞因子风暴。②CAR-NK细胞不会引起移植物抗宿主反应(GVHD)[38]。③CAR-NK细胞具有较强的杀伤肿瘤细胞功能，不仅可以通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用 (ADCC)途径，也可以经各种非特异性途径杀伤肿瘤细胞。以CD19、CD20、CD244和 HER2为靶抗原的 CAR-NK92细胞在临床前试验中已表现出极强的抗肿瘤效果[39]。但CAR-NK细胞仍存在脱靶效应、转染率低等问题，我们尚需优化CAR-NK结构、转染方法等以制备最佳的免疫细胞。

5 结语

CAR-T细胞免疫治疗是一种发展前景广泛的抗肿瘤方法，在临床应用中已获得一定的疗效，但由于肿瘤细胞的异质性和肿瘤免疫微环境的改变，CAR-T细胞疗法在大多数肿瘤的治疗中并不能取得理想的结果，尤其是实体瘤。因此在新一代的CAR-T细胞设计中，我们必须优化设计方案、构建最佳的CAR-T 细胞 、降低毒性效应，提高CAR-T细胞治疗的安全性和有效性。同时CAR-T细胞外泌体治疗、局部CAR-T细胞治疗等方法将会是未来CAR-T细胞治疗体系中极其重要的部分。相信通过大家的不懈努力，CAR-T细胞疗法将会克服各种障碍，成为继三大常规肿瘤治疗方法的新主流，为肿瘤患者带来新的希望。

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[收稿2016-11-17 修回2017-01-17]

(编辑 倪 鹏)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.09.034

①本文受安徽省科技攻关项目(1604a0802072)资助。

鲁大鹏(1990年-)，男，在读硕士，主要从事CAR-T细胞与肺癌的相关性研究，E-mail：742654086@qq.com。

及指导教师：王保龙(1965年-)，男，博士，主任检验师，主要从事肺癌方面的研究，E-mail：wbl196555@163.com。

R730.51

A

1000-484X(2017)09-1430-05