肝细胞癌免疫检查点阻断治疗的研究进展

康富标 王 玲 孙殿兴

(解放军白求恩国际和平医院全军肝病诊治中心，石家庄050082)

肝细胞癌免疫检查点阻断治疗的研究进展

康富标 王 玲①孙殿兴

(解放军白求恩国际和平医院全军肝病诊治中心，石家庄050082)

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国高发的恶性肿瘤之一。据估计，全球约有50%的新发病例出现在我国，在肿瘤相关死亡中仅次于肺癌而位居第2位。HCC起病隐匿、进展迅速，早期诊断和外科手术率较低，且对放化疗反应差，亟待探索新的治疗手段。免疫检查点(Immune checkpoint)是指通过下调机体免疫反应，控制效应细胞过度激活而避免免疫病理损伤的分子。肿瘤细胞利用人体免疫系统特性，通过过表达免疫检查点分子，抑制抗肿瘤免疫反应，进而逃避免疫监视和杀伤，促进肿瘤生长。免疫检查点阻断即通过打破肿瘤免疫逃逸机制，活化效应细胞，发挥抗肿瘤作用。本文将初步阐释免疫检查点阻断治疗在HCC中的研究进展。

1 肝细胞癌免疫治疗现状

肝细胞癌的传统免疫治疗主要包括细胞因子治疗、肿瘤疫苗及过继细胞治疗(Adoptive cell therapy,ACT)等。重组人干扰素α(IFN-α)因其免疫刺激和抗血管生成作用是首个用于肝细胞癌的细胞因子，但研究发现对于改善预后并无裨益[1]。肿瘤疫苗通过激活体内特异性T细胞对肿瘤产生免疫杀伤作用，主要包括多肽、蛋白和核糖核酸疫苗以及树突状细胞(Dendritic cells,DCs)疫苗。来源于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican-3,GPC3)的多肽疫苗被发现可诱导HCC组织内CD8阳性T细胞浸润，且GPC3特异性CTL反应强度与总体生存时间呈正相关，但总计33例患者中仅有1例可观察到肿瘤的客观反应[2]。研究发现，多种DCs疫苗单独或联合其他抗肿瘤治疗用于HCC在多数患者体内可诱导特异性抗肿瘤免疫反应，并可能延缓复发和转移，维持病情稳定，但仅有少数患者可观察到包括甲胎蛋白降低、肿瘤体积缩小等直接抗肿瘤活性[3,4]。目前用于HCC的ACT主要是细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokines induced killer cells,CIKs)治疗。肿瘤浸润淋巴细胞因获取困难而鲜有系统研究，T细胞基因编辑技术，包括TCR克隆技术和嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)技术，目前尚未见用于HCC的报道[5]。CIKs是将患者外周血单个核细胞分离，体外采用IL-1、IL-2、IFN-γ和CD3单抗等诱导、增殖而获得的一群异质性细胞，据报道可改善患者生存质量、减少术后复发并延长生存时间，但具体疗效和临床应用价值尚存争议。两项入组患者分别超过100例的随机对照实验显示CIK治疗可延缓HCC术后肿瘤复发，但对于总体生存率并无影响[6,7]。另一项回顾性研究则显示手术切除联合CIK辅助治疗与单独手术组比较，5年生存率可显著提高(65.9% & 50.2%)[8]。研究结果的不一致性可能与不同人群肿瘤免疫原性差异、CIK治疗操作缺乏规范等因素有关。

因此，虽然HCC的免疫治疗备受关注，但仍然存在疗效不确定、特异性较差等问题，亟待寻求更为规范、有效的治疗策略，免疫检查点阻断无疑为此提供了新的方向[5,9]。

2 免疫检查点阻断治疗概述

免疫检查点阻断是目前肿瘤免疫治疗的热点之一，针对CTLA-4和PD-1分子的阻断抗体在多种恶性肿瘤中取得突破性疗效并已进入临床应用[10-12]。CTLA-4抑制剂主要包括Ipilimumab和Tremelimumab，其中IgG1亚型抗体Ipilimumab是首个用于临床的免疫检查点抑制剂，目前已被美国食品和药品管理局(FDA)批准用于转移性恶性黑色素瘤，表现出良好的抗肿瘤效果和可接受的耐受性[13]。IgG4亚型完全人源化PD-1抗体Nivolumab被批准用于治疗BRAF野生型及采用Ipilimumab和BRAF抑制剂治疗无效的BRAF突变型恶性黑色素瘤患者和晚期非小细胞肺癌患者，与CTLA-4抑制剂相比，Nivolumab疗效更好且副作用更低，具有明显的临床推广优势[14-16]。另一种PD-1抑制剂Pembrolizumab也被批准用于晚期恶性黑色素瘤，被发现对Ipilimumab治疗无效的患者仍然起作用[17]。

针对肾癌、膀胱癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤等多种肿瘤的检查点阻断治疗的临床研究也在进行中。Ansell等[18]采用Nivolumab对23例复发或难治性霍奇金淋巴瘤患者的治疗研究发现，PD-1阻断抗体表现出持续的治疗活性和可接受的副作用，该药也因此获得FDA突破性疗法认定，用于自体干细胞移植和Brentuximab Vedotin治疗失败的霍奇金淋巴瘤患者的治疗。另一项入组60例复发/转移性头颈部肿瘤患者接受Pembrolizumab单药治疗后，客观缓解率可达20%[19]。B7-H1阻断抗体BMS-936559用以治疗非小细胞肺癌、黑色素瘤和肾细胞癌的研究发现，患者在开始投药后24周可出现肿瘤消退并且疾病维持稳定[20]。另一项临床实验应用B7-H1阻断抗体MPDL3280A同样在转移性膀胱癌患者表现出客观的临床收益[21]。此外，针对CTLA-4和PD-1/B7-H1位点联合阻断或免疫检查点阻断联合化疗、靶向治疗等多种治疗策略也在研究中，有望获得更高的治疗反应率和更长的生存时间。

3 肝细胞癌免疫检查点阻断治疗研究

3.1 CTLA-4 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 (Cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4,CTLA-4/CD152)诱导性表达于活化的效应性T细胞(Effector T cells,Teffs)或组成性表达于调节性T细胞 (Regulatory T cells,Tregs)表面。CTLA-4通过竞争性结合抗原提呈细胞表面的CD80和CD86分子，负向调控T细胞的活化状态，抑制免疫反应。阻断CTLA-4信号可导致肿瘤组织Teffs的大量扩增、活化，进而增强抗肿瘤作用。CTLA-4阻断抗体还可解除Tregs对杀伤细胞的接触性抑制，并降低转化生长因子β(Transforming growth factor,TGF-β)和白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)等细胞因子的分泌水平[22]。此外，CTLA-4抗体还可能通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)介导了肿瘤微环境中巨噬细胞或NK细胞对Tregs的选择性删除[23]。

Chen等[24]通过射频消融联合瘤内注射粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor,GM-CSF)和CTLA-4阻断抗体可使肝癌荷瘤小鼠原发病灶完全清除，50%远隔病灶消失，再次荷瘤90%个体因肿瘤排斥而失败，提示阻断CTLA-4强化了机体抗肿瘤免疫反应。研究发现，HCC组织CTLA-4阳性Tregs的浸润水平明显升高，且与疾病的进展和预后密切相关[25]。通过CTLA-4抗体可解除肿瘤微环境中Tregs细胞的抑制作用，重建杀伤细胞的数量和功能。

Tremelimumab是IgG2a亚型的CTLA-4抗体，一项入组21例旨在探讨Tremelimumab用于慢性丙型肝炎相关HCC的Ⅰ期临床实验表明，17.6%的患者出现部分应答，45%病情稳定超过6个月，且患者耐受性良好，未出现治疗相关的死亡事件。值得注意的是，治疗期间稳定的干扰素γ(IFN-γ)水平可预示更好的抗肿瘤免疫反应，提示肿瘤免疫原性对CTLA-4阻断抗体治疗的疗效至关重要[26]。目前，采用Tremelimumab联合化疗栓塞或射频消融(NCT01853618)和Ipilimumab联合立体定位放疗(NCT02239900)用于HCC的临床研究正在进行中。

3.2 PD-1和B7-H1 程序性死亡受体1(Progra-mmed death 1,PD-1/CD279)属于CD28家族成员，主要表达于活化的T细胞、B细胞、树突状细胞和巨噬细胞表面。B7-H1 (B7 homolog 1)作为PD-1介导免疫抑制最主要的配体，在抗原提呈细胞组成性表达，而在几乎所有活化淋巴细胞和外周组织细胞表面可诱导性表达。B7-H1/PD-1途径在T细胞活化的负性调节上扮演关键角色并在肿瘤免疫抑制机制上发挥重要作用。PD-1作为抑制性受体表达于活化的T细胞表面，负向调节T细胞功能。高表达PD-1的抗原活化CD8阳性T细胞表型被定义为“T细胞耗竭(T cell exhaustion)”表型，该表型的T细胞往往失去增殖能力并倾向于发生凋亡，同时细胞因子和效应分子的分泌能力也明显下降。

B7-H1/PD-1分子途径是目前已知肿瘤发挥免疫逃逸的主要机制之一。B7-H1在肿瘤微环境中表达水平明显上调，与之对应，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)则高表达PD-1分子[27]。TILs在接受肿瘤细胞表达的B7-H1信号后丧失杀伤功能，进而凋亡，使肿瘤逃避了免疫攻击而得以保存、生长甚至转移。B7-H1分子如同在肿瘤细胞表面的一层“保护网”，不仅保护肿瘤免受攻击，而且会诱导接触的杀伤细胞失能，被称为“分子筛”[28]。B7-H1/PD-1分子通路在HCC的进展中扮演重要角色。多项研究表明，HCC患者肿瘤细胞B7-H1的表达、肿瘤浸润T细胞PD-1的表达和外周血T细胞PD-1的表达，均与患者肿瘤分期、术后复发率和预后呈显著相关性[29,30]。

Nivolumab是一种全长人IgG4亚型PD-1阻断抗体。一项旨在评价Nivolumab对于进展期HCC的国际多中心Ⅰ/Ⅱ期临床实验表明，总计39例患者中，完全应答2例，部分应答7例，72%的患者生存期超过6个月[31]。研究发现，PD-1阻断治疗可能靶向多激酶抑制剂索拉菲尼耐药的肝癌细胞而与后者具有协同作用[32]。目前，针对进展期肝癌采用Nivolumab单药或联合Ipilimumab的临床研究(NCT01658878)，以及Nivolumab与TGF-β受体激酶抑制剂Galunisertib(NCT02423343)和多激酶抑制剂索拉菲尼(NCT02576509)的临床研究均在进行中。PD-1阻断剂Pembrolizumab用于HCC或包括HCC的实体瘤的临床研究已有多项注册开展。B7-H1阻断抗体MEDI4736用于包括HCC在内的26例实体瘤患者均表现出良好的耐受性和可见的治疗反应，3级以上的副作用发生率仅为7%，且没有中断治疗病例[33]。MEDI4736与Tremelimumab联合或单药治疗无法切除的HCC的临床实验也正在进行中(NCT02519348)。

多数对PD-1或B7-H1阻断治疗产生应答的患者，均存在肿瘤组织B7-H1的高表达。B7-H1基因启动子区域有IFN-γ反应元件，因此炎症性细胞因子IFN-γ是B7-H1表达上调的关键因素。在我国，HCC多发于炎症性肝病的基础上，提示HCC较其他肿瘤有更高的B7-H1表达倾向，可能更适宜采用B7-H1/PD-1阻断治疗。

3.3 TIM-3 T细胞免疫球蛋白及黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin and mucin-3,TIM-3)主要表达于活化的T细胞以及树突状细胞、单核-巨噬细胞、NK细胞等固有免疫细胞。研究发现，PD-1和TIM-3的基因多态性与HBV相关HCC的预后有关[34]。TIM-3通过与其配体Galectin-9结合可诱导Th1细胞发生凋亡，并可降低Th17细胞活性进而诱导免疫抑制。肿瘤浸润CD8阳性T细胞多共表达TIM-3和PD-1，较单独表达PD-1的细胞细胞因子分泌能力更低，杀伤功能更差，提示存在更为严重的功能耗竭。通过封闭性抗体或小干扰RNA抑制TIM-3信号通路可逆转肿瘤组织中T细胞、NK细胞的功能耗竭，联合阻断PD-1和TIM-3信号通路可显著恢复杀伤细胞的抗肿瘤效应[35,36]。Li等[37]报道，在HBV相关HCC患者中，TIM-3阳性T细胞的浸润水平与患者预后呈负相关，TIM-3/galectin-9信号通路介导了肿瘤微环境中T细胞的功能障碍。TIM-3还可通过增强TGF-β介导的HCC组织肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的M2亚型极化，进而促进肿瘤生长[38]。因此，在HCC中，针对TIM-3或联合B7-H1/PD-1的阻断治疗可能成为一个新的免疫治疗模式。

3.4 B7-H3 B7-H3是由316个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，最初是通过对人树突状细胞来源的cDNA库进行核酸序列分析得到的B7家族同源基因，属于免疫球蛋白超家族。B7-H3在机体正常组织基本不表达，而在包括前列腺癌、恶性黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中均显著高表达。研究发现，HCC组织B7-H3的表达水平也明显升高，且与肿瘤分期、侵袭转移和预后密切相关，B7-H3可通过JAK-2/Stat-3/Slug通路介导肝癌细胞的上皮间质转化，进而影响肿瘤的侵袭、转移能力[39]。此外，HCC细胞还可通过B7-H3诱导TAMs发生M2亚型极化，有助于维持肿瘤组织中抑制性免疫环境[40]。

B7-H3的表达水平还与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性有关。比如，下调多种人乳腺癌细胞系的B7-H3的表达会导致其对紫杉醇的敏感性增加而发生药物诱导的凋亡，过表达B7-H3则显著提升肿瘤耐药阈值[41]。Zhao等[42]也发现慢病毒介导的B7-H3沉默增加了人胰腺癌细胞系Patu8988对吉西他滨的敏感性。8H9是一种抗B7-H3单克隆抗体，通过ADCC和补体依赖性细胞毒机制发挥作用。8H9(Fv)-PE38是采用8H9的Fv亚单位和假单胞菌毒素PE38构建的嵌合蛋白，在乳腺癌、骨肉瘤和神经母细胞瘤模型中可导致肿瘤的明显消退[43]。另一种B7-H3单克隆抗体MJ18，被发现在胰腺癌模型中可诱导强大的抗肿瘤效应并明显抑制肿瘤生长[44]。鉴于B7-H3在HCC中与病程和预后显著相关的高表达，B7-H3阻断治疗或联合化疗作为增敏剂、联合其他免疫治疗，如CTLA-4阻断剂等，可能作为HCC免疫治疗研究的有效突破点。

3.5 其他免疫检查点分子 B7-H4是新发现的T细胞共抑制分子，在多种肿瘤组织高表达，可通过影响细胞生长和调节免疫反应两种机制介导肿瘤免疫逃逸[45]。研究发现，B7-H4表达强度与肿瘤患者临床转归密切相关并可能作为预后不良的有效预测指标[46]。Zhang等[47]报道，HCC患者血清高B7-H4水平预示更差的临床转归和更高的复发可能。采用三氧化二砷可降低肝癌细胞系MHCC97-H的B7-H4表达，进而影响了细胞的成瘤和肿瘤生长能力，提示阻断B7-H4可能是HCC有效的治疗靶点[48]。

HVEM(Herpesvirus entry mediator)是TNF受体超家族成员，广泛表达于T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞及多种肿瘤细胞。HVEM可与LIGHT分子结合，刺激T细胞增殖并促进其分泌IFN-γ，还可与BTLA(B and T lymphocyte attenuator,CD272)和CD160结合，降低T细胞增殖能力和IL-2产生水平，负向调控免疫反应[49]。在恶性T淋巴细胞增殖性疾病中，BTLA和PD-1均可下调临近T细胞的受体信号级联反应。其中，PD-1广泛负性调节免疫反应，而BTLA主要抑制CD8阳性肿瘤特异性T细胞，且二者可能发挥协同效应，提示B7-H1/PD-1和HVEM/BTLA联合阻断可能作为免疫检查点治疗的优化策略[50]。研究发现，HCC组织高表达HVEM，且与术后复发和生存率有关，HVEM表达水平与肿瘤浸润T细胞的数量和颗粒酶、穿孔素及IFN-γ的产生能力呈反相关，提示HVEM可能与BTLA和/或CD160结合，抑制T细胞功能，参与肿瘤免疫逃逸机制，靶向HVEM/BTLA/CD160通路可能有效恢复抗肿瘤免疫[51]。

此外，LAG-3 (Lymphocyte activation gene-3)、TIGIT(T cell immunoglobulin and ITIM domain)、VISTA(V-domain immunoglobulin-containing suppre-ssor of T cell activation)等多种抑制性分子也作为肿瘤检查点治疗的靶向分子进行实验和临床前期研究，但这些分子在HCC中的表达和作用有赖于进一步的深入研究[10]。

4 结语

免疫检查点治疗策略并非完美无瑕。首先，研究发现，免疫检查点治疗的疗效与肿瘤的免疫原性有关[52]。强免疫原性及在治疗过程中存在持续、高强度的特异性免疫反应预示更高的应答率和更好的临床效果。免疫原性较强的肿瘤，如恶性黑色素瘤、前列腺癌等，往往更适用于免疫治疗。第二，在对PD-1或B7-H1阻断治疗的研究中发现，肿瘤细胞对免疫治疗可发生适应性改变，导致针对免疫治疗制剂发生耐药或部分耐药。第三，肿瘤组织往往通过多种机制发生免疫逃逸，多种负性调控分子如CTLA-4、PD-1、B7-H1、B7-H3等均可能参与了特定的过程。肿瘤细胞可能通过不同机制之间的相互协同对抗单信号通路阻断的免疫治疗，从而降低临床疗效。PD-1和CTLA-4阻断抗体联合应用或检查点阻断联合靶向治疗可能会发挥更好的抗肿瘤作用[53,54]。第四，由于多种检查点分子并非肿瘤组织特异性表达，阻断特定分子通路势必改变机体免疫稳态，可能存在发生自身免疫性疾病或导致免疫病理损伤的潜在风险。肿瘤组织局部投药可能适当减少副作用，但特定制剂的应用风险尚需通过动物实验和临床实验的谨慎观察评估[55,56]。

免疫检查点治疗无疑为人类对抗肿瘤性疾病提供了新的强有力的工具，如何最大限度发挥效应并规避风险，需要对肿瘤免疫逃逸机制的进一步理解，以及对特定制剂单药治疗或联合治疗的完善的临床前实验和临床研究。虽然HCC发生和进展机制复杂，但免疫系统无疑在其中扮演了关键角色。免疫检查点治疗在实验和临床研究中取得令人鼓舞的效果，为HCC的免疫检查点治疗提供了可靠的理论和实践基础，相信更多的免疫治疗制剂必将脱颖而出，为HCC患者带来新的希望。

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[收稿2016-05-04 修回2016-06-12]

(编辑 倪 鹏)

康富标(1977年-)，男，医学博士，主治医师，主要从事肝脏疾病的免疫学研究和临床诊治工作，E-mail：kangfb@hotmail.com。

R735.7

A

1000-484X(2017)02-0313-06

①河北医科大学第四医院肿瘤研究所，石家庄050011。