含幽门螺杆菌特异性抗体牛奶清除幽门螺杆菌效果的临床随机试验①

赵连梅 魏思思 武一鹏 刘维华 赵 川 胡代伦 李胜棉 王 苋 单保恩

(河北医科大学第四医院科研中心,石家庄050011)

含幽门螺杆菌特异性抗体牛奶清除幽门螺杆菌效果的临床随机试验①

赵连梅 魏思思 武一鹏 刘维华②赵 川②胡代伦③李胜棉 王 苋②单保恩

(河北医科大学第四医院科研中心,石家庄050011)

目的：比较观察抗幽门螺杆菌抗体牛奶根除幽门螺杆菌的效果。方法：用4株幽门螺杆菌(1株为标准菌株，3株为本地流行菌株)免疫奶牛，制备出抗幽门螺杆菌抗体牛奶。本次试验共筛选148例患者，C-14呼气试验阳性的患者为72例，最后符合入选标准的为39例，将符合标准的患者随机分为试验组和对照组，分别为21例和18例，试验组饮用含特异性幽门螺杆菌抗体的牛奶，对照组饮用普通牛奶，连续饮用2个月后，观察结果。结果：试验组的21名对象中，9人C-14呼气试验转为阴性，10人降低。有效清除率达42.86%，而对照组未有清除，两组清除率有统计学意义(P=0.005，P<0.05)。结论：抗幽门螺杆菌抗体牛奶具有多克隆性和很高的效价，能够有效清除胃内幽门螺杆菌。

幽门螺杆菌;抗体牛奶;临床随机试验

幽门螺杆菌( Helicobacter pylori,H.Pylori)是一种定植于人胃黏膜的微需氧革兰阴性杆菌。H.Pylori感染属世界范围性，约有半数以上的人口胃内有H .Pylori定居。H.Pylori感染可引起慢性B型胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌等，严重威胁着人类健康[1]。1996年WHO将其列为“一级致癌因子”。近年研究表明，H.Pylori感染与不明原因缺铁性贫血、慢性特发性血小板减少性紫癜、阿尔茨海默病、结直肠腺瘤和结肠癌的发生均有相关性[2]。长期以来，我们使用多种抗生素的联合疗法来根除H.Pylori，虽然有效,但H .Pylori对抗生素的耐受性逐渐增加，根除率逐年下降。1998年意向性分析(Per-Protocol，PP)和符合方案集分析(Intent-To-Treat，ITT)根除率分别可达95.2%、92%，目前PP和ITT根除率分别是65.1%、63.5%，根除率下降趋势仍将继续，寻找“H.Pylori治疗新路径”[3]是今后H.Pylori治疗的研究方向。与其他病原菌一样，免疫防治可能是最有效的方法。用抗H.Pylori多克隆抗体牛奶防治H.Pylori感染或许可以成为一种新的最有效的途径。本实验用幽门螺杆菌混合菌株免疫奶牛，制备含幽门螺杆菌特异性抗体的牛奶，对C-14呼气试验阳性的患者进行临床随机对照试验，进而观察此种抗体牛奶对幽门螺杆菌的根除效果。

1 材料与方法

1.1 材料 用来免疫奶牛的菌株选用国际标准菌株SS1和三株本地流行的临床株作为混合免疫抗原，三株临床株毒力型为临1(S1bS2m1a)，临2(S2m1am1bi2)，临3(S1am2i2)，本地流行的临床株由河北医科大学第四医院和石家庄市疾控中心联合筛选。病例来自河北医科大学第四医院消化内科就诊人员，共筛选148例患者,C-14呼气试验阳性的患者为72例,最后符合入选标准的为39例。以下为入选标准：①C-14尿素呼气试验阳性；②停用治疗胃病的药物或抗菌素两周以上；③征询患者同意，自愿入组。检测牛奶抗体的ELISA试剂盒购自皮尔斯TMBCA蛋白浓度测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司，Waltham，MA，USA)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的保存与培养 将菌株保存于含有20%甘油和10%FBS的冻存液中，置于-80℃冰箱。在哥伦比亚平板上，微氧条件(10%CO2、85%N2、5%O2)下，37℃、95%湿度培养3～10 d，用无菌环选取细菌，用0.9%无菌盐水洗3遍，最后悬浮于0.1 mol/L的PBS缓冲液中作为疫苗，保存于-80℃备用。

1.2.2 抗H.pylori抗体牛奶的制备与消毒 选用4种菌株作为混合抗原，免疫4头孕期奶牛，总共免疫8次，2次在生产前最后1个月，6次在生产后。每次免疫菌量为6×109cfu H .Pylori。通过鼻黏膜滴注、乳上淋巴结的皮下注射和臀部肌肉注射进行免疫，平均每2周加强免疫1次。用等体积的免疫佐剂乳化幽门螺杆菌悬液，初始免疫时用弗氏完全佐剂，每次加强免疫用弗氏不完全佐剂。在免疫以前和免疫50 d后分别收集牛奶进行抗体检测。抗体牛奶和普通牛奶都进行巴氏消毒，备用。

1.2.3 ELISA检测抗体牛奶中的抗体量 用1×PBS分别稀释抗体牛奶和对照牛奶100、200、400和800倍，每孔100 μl加入酶标板，37℃孵育1 h，清洗；使用含0.1%BSA的1×PBS 1∶8 000 稀释HRP标记二抗，每孔100 μl加入酶标板，室温孵育30 min，清洗；最后显色，在450nm处测定吸光度值。

1.2.4 临床试验 本研究为随机临床试验，将符合入选标准的39例患者按完全随机方法分入试验组和对照组，采用执行者和患者双盲原则分发、饮用牛奶。试验组21名,饮用特异性抗体牛奶200 ml/d+1 ml NaHCO3(1 mol/L);对照组18名,饮用普通牛奶200 ml/d+1 ml NaHCO3(1 mol/L),同时饮用2个月，测定C-14呼气试验值，观察结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件进行处理，试验组和对照组幽门螺杆菌清除率的比较采用χ2检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 用ELISA检测不同稀释度下的抗体奶中4种菌株抗体的浓度 结果证明，抗体奶含有较高的特异性抗体浓度，抗体效价也比较高，表1。

2.2 抗体牛奶饮用效果评价 本研究共纳入39例受试者。试验组21例，饮用抗体牛奶，有9例C-14尿素呼气试验转阴，10例数值明显下降，具体数值变化见表2；对照组18例，未有转阴者。通过统计分析，试验组有效清除率为42.86%，对照组未有有效清除率，有统计学意义(P=0.005，P<0.05)。

2.3 不良反应 本次实验试验组和对照组均无不良反应者。

表1 不同稀释度下的抗体奶中特异性抗体浓度

Tab.1 Special concentration of antibodies under different dilution of milk

ProportionofmilkSS1Clinicalsample1Clinicalsample2Clinicalsample3Control1∶100294627802755274402151∶200270119422071197102421∶4002099123714709891∶8001408081809820647

表2 受试者服用抗体牛奶前后C-14呼气试验数值变化

Tab.2 Values of C-14 in volunteer who drink antibody milk at different time

NoBeforeAfterNoBeforeAfter11029Negative124544032126337613108479431382Negative14590Negative4390017821512004175263Negative161663138861364168417358011007143Negative18384Negative836836519780Negative9244358820742Negative1013177502142328011110Negative

3 讨论

我国自然人群幽门螺杆菌的感染率为54.76%，广东地区H.Pylori感染率最低为42.01%，西藏H.Pylori的感染率最高为84.62%[4]。H.Pylori的高阳性率基本显示与胃内病变的一致性。几年内的感染多数仅能引起轻度的浅表性胃炎；但数十年的长期慢性感染易出现糜烂、疣状胃炎、萎缩性胃炎甚至胃肿瘤。因此，寻找一种有效且易执行的治疗方法非常重要。

先前的体外研究表明，抗幽门螺杆菌抗体牛奶具有很好的治疗效果，但尚无体内临床研究显示它的根除作用[5-14]。本研究表明，用H.Pylori全菌体抗原免疫奶牛,能够获得很高效价的多克隆免疫牛奶，服用这种抗体牛奶不仅有很好的清除效果，且能改善一些临床症状，无不良反应的发生。由于不同国家的不同地区之间H.Pylori的基因型和血清型明显不同，即使是同一国家的不同地区之间也有很大区别[15，16]，因此我们选择了一株标准菌株和三株当地的流行菌株作为混合抗原。已有研究表明，胃内pH会影响牛奶中的特异性抗体与H.Pylori的结合，pH4.0以下不能有效结合，pH在7.0～8.0时能达到最大程度结合[17]。因此，本研究中，饮用抗体奶时需加入NaHCO3，提高胃黏膜的pH值，促进特异性抗体的吸收与结合。本研究中试验组的21例受试对象中，有9例C-14尿素呼气试验转阴，10例数值明显下降，而对照组的18例对象中，未有转阴者，结果有统计学意义。

目前,广泛用于临床根除H.Pylori的方案是抗生素抗菌治疗，虽然疗效肯定，但也有不甚理想之处：①耐药率与日俱增；②大量长期服用药物及胃肠道副反应，很多患者难以耐受，依从性差；③不可用做预防用药。使用抗H.Pylori抗体牛奶治疗H.Pylori感染有许多优势，比如低成本、高营养、好的耐受性、不会形成抗生素耐药且可以耐受长期使用等等。因此，被动免疫治疗或许是防治H.Pylori感染最有效的途径。

已有动物实验证实，口服抗尿素酶IgA单克隆抗体可保护小鼠不受H.Pylori感染,分泌型IgA( sIgA )在儿童期防止消化道H.Pylori感染中有重要作用,母乳中的IgA 被摄入后能在消化道黏膜表面清除外来微生物，或随食物咽下的抗原[18]。这些实验为我们进行口服抗体治疗揭示了美好的前景。牛奶中含有丰富的sIgA,研究特异性的抗H.Pylori抗体牛奶有很大应用价值。以往的研究表明，服用含抗H.Pylori特异性抗体的牛奶,无任何不良反应[19]。目前，国内外有不少有关通过摄取免疫食品中的特异性抗体，来中和致病菌特异性毒力因子，防治消化道疾病,治疗类风湿关节炎,预防龋齿的报道[20]。但有关抗H.Pylori的免疫制剂的报道还不多见。用免疫乳作为对H.Pylori带菌者预防性清除投药,对胃肠道无刺激,对肠道菌群无干扰,通过免疫乳制品,使特异性抗体进入胃肠道发挥治病、防病作用，这将是一种经济、方便的方法。

虽然临床效果和应用前景都较好，但仍存在一些问题：筛选区域临床流行株费时,费力；免疫菌株和感染者胃中的菌株差异比较大；免疫奶牛后，奶牛产奶量下降等，对此，我们将做进一步探究。

[1] Parsonnet J,Hansen S,Rodriguez L,etal.Helicobacter pylori infection and gastric lymphoma [J].N Engl J Med，1994,330(18):1267-1271.

[2] Malfertheiner P,Selgrad M,Bornschein J.Helicobacter pylori:clinical management [J].Curr Opin Gastroenterol,2012,28 (6):608-614.

[3] 胡伏莲.幽门螺杆菌感染治疗新路径 [J].中华医学杂志,2012,92(10)：649-651.

[4] 张万岱，胡伏莲，萧树东，等.中国自然人群幽门螺杆菌感染的流行病学调查 [J].现代消化及介入诊疗,2010,15(5):265-270.

[5] Attallah AM,Abbas AT,Ismail H,etal.Efficacy of passive immunization with IgY antibodies to a 58-kDa H.Pylori antigen on severe gastritis in BALB/c mouse model [J].J Immunoass Immunochem,2009,30940:359-377.

[6] Czinn SJ,Cai A,Nedrud JG.Protection of germ-free mice from infection by Helicobacter felis after active oral or passive IgA immunization [J].Vaccine，1993,11(6):637-642.

[7] Gorrell RJ,Robins-Browne RM.Antibody-mediated protection against infection with Helicobacter pylori in a suckling mouse model of passive immunity [J].Infect Immun,2009, 77(11):5116-5129.

[8] Marnila P,Rokka S,Rehnberg-Laiho L,etal.Prevention and suppression of Helicobacter felis infection in mice using colostral preparation with specific antibodies [J].Helicobacter,2003,8(3):192-201.

[9] Casswall TH,Nilsson HO,Bjorck L,etal.Bovine anti-Helicobacter pylori antibodies for oral immunotherapy [J].Scand J Gastroenterol,2002,37(12):1380-1385.

[10] Casswall TH,Sarker SA,Albert MJ,etal.Treatment of Helicobacter pylori infection in infants in rural Bangladesh with oral immunoglobulins from hyperimmune bovine colostrum [J].Aliment Pharmacol Ther，1998, 12(6):563-568.

[11] den Hoed CM,de Vries AC,Mensink PB,etal.Bovine antibody-based oral immunotherapy for reduction of intragastric Helicobacter pylori colonization:a randomized clinical trial [J].Can J Gastroenterol,2011,25(4):207-213.

[12] Suzuki H,Nomura S,Masaoka T,etal.Effect of dietary anti-Helicobacter pylori-urease immunoglobulin Y on Helicobacter pylori infection [J].Aliment Pharmacol Ther,2004,20(Suppl 1):185-192.

[13] Wang B,Yang J,Cao S,etal.Preparation of specific anti-Helicobacter pylori yolk antibodies and their antibacterial effects [J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(10):6430-6437.

[14] Bitzan MM,Gold BD,Philpott DJ,etal.Inhibition of Helicobacter pylori and Helicobacter mustelae binding to lipid receptors by bovine colostrum [J].J Infect Dis，1998,177(4):955-961.

[15] Cohung C,Olivares A,Torres E,etal.Diversity of VacA intermediate region among Helicobacter pylori strains from several regions of the world [J].J Clin Microbiol,2010(3),48:690-696.

[16] Dabiri H,Maleknejad P,Yamaoka Y,etal.Distribution of Helicobacter pylori cagA,cagE,oipA and vacA in different major ethnic groups in Tehran,Iran [J].J Gastroenterol Hepatol,2009,24:1380-1386.

[17] Early EM,Hardy H,Forde T,etal.Bactericidal effect of a whey protein concentrate with anti-Helicobacter pylori activity [J].J App Microbiol,2001,90:741-748.

[18] 李仕英，时兰春，王缚鲲，等.含抗幽门螺杆菌特异性抗体牛奶清除效果的动物实验研究 [J].中华医院感染学杂志,2010,20(9)：1230-1232.

[19] 高东旗，李仕英，王庭贵.抗幽门螺杆菌和伤寒杆菌特制牛奶的毒理实验研究 [J].医学动物防制，2005,21(2):81-82.

[20] 边 专，樊明文，杜民权，等.变形链球菌Gtase高表达株免疫奶牛应用研究 [J].口腔医学纵横杂志，1999,15(1):1-3.

[收稿2016-08-22]

(编辑 许四平)

Clearance effect of milk containing anti-Helicobacter pylori specific antibody:a randomized clinical trial

ZHAOLian-Mei，WEISi-Si，WUYi-Peng,LIUWei-Hua，ZHAOChuan，HUDai-Lun，LISheng-Mian，WANGXian，SHANBao-En.

ResearchCenter，theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011，China

Objective:To compare and observe the different clearance effect of milk containing anti-Helicobacter pylori specific antibody.Methods: Four H.pylori strains were used to immune dairy cows to obtain milk containing anti-Helicobacter pylori specific antibody,of which,one was standardized strain and the other three were locally epidemic.Totally 148 people were screended,in which 72 were C-14 urea breath test positive,finally 39 meet the criteria.They were divided into two groups,the test group contained 21 subjects,were treated milk containing anti-Helicobacter pylori specific antibody;the 18 subjects in control group with common milk.The study was continued for 2 months.Results: Conducting the C-14 urea breath test,9 subjects in test group were negative,but no one was changed in control group.The effective clearance rate of the test group was 42.86%,and there was no effective clearance in the control group,so there was significant difference in the two groups(P=0.005，P<0.05).Conclusion: The milk containing anti-Helicobacter pylori specific antibody is polyclonal and has higher valence,and could clear H .Pylori effectively.

Helicobacter pylori；Antibody milk；Randomized clinical trial

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.023

①本文受国家自然科学基金(81502032)、河北省中医药管理局研究项目(2015130)和河北省自然科学基金(H2015206376)项目资助。

赵连梅(1981年-)，女，博士，副研究员，主要从事肿瘤免疫学及分子生物学机制相关研究，E-mail：lianmeizhmail@163.com。

及指导教师：单保恩(1962年-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事肿瘤免疫学相关研究，E-mail：shanbaoen@163.com。

R186

A

1000-484X(2017)02-0274-04

②石家庄市疾控中心，石家庄050011。

③河北医科大学临床学院，石家庄050031。