通过生化和蛋白组学分析探究应激标记

李岑岑（译）

（华中农业大学农业部重点实验室，湖北 武汉 430070）

通过生化和蛋白组学分析探究应激标记

李岑岑（译）

（华中农业大学农业部重点实验室，湖北 武汉 430070）

荐语：随着全球畜牧业发展和国际贸易自由化、规范化进程加快，动物福利越来越受到关注，故客观评估动物的福利水平至关重要。然而，目前的研究大多局限于基于动物表型以检测动物的福利水平，而评估动物福利水平的实验室生物标记信息很少，本文对不同饲养密度下母猪的应激进行了生化与蛋白组学分析，以期获得一套客观且易于检测的实验室参数用于动物福利的评估。

1 研究背景

妊娠期间母猪通常被安置于单个畜栏，这样母猪易于管理，其群体应激减少，且易饲喂。然而，福利专家认为这种单独的饲养系统会对动物产生应激，对动物是有害的，因此，欧盟已经禁止这种做法。妊娠母猪的限位栏饲养使其活动空间有限，容易发生皮肤擦伤、行动困难、肌肉质量下降和骨抗压力丧失等现象。此外，相比于群养的母猪，单独饲养的母猪更容易发生异常的行为和繁殖问题。

尽管客观评估应激很重要，但是其实验室生物标记的信息很少，有些文章已经评估了基于动物表型的有效性以检测母猪的福利。如假装咀嚼或过度饮水的行为表明单独饲养的母猪在单个畜栏有所不适。不过我们也观察到相反的结果，虽然限位栏饲养的母猪其打斗行为和假咀嚼行为很容易发生，但是群居母猪的饮水频率要比单畜栏饲养的母猪高。

因此，获得一套客观且易于检测的实验室参数作为福利评分将是检测动物福利的一个重要因素。动物行为、生物化学、生理学和免疫学的互补性以及现代高通量技术的使用有助于为动物的饲养和管理创造更全面的科学基础。

我们小组以前的研究已经定义了潜在的实验室标记来评估不同饲养密度下公猪的应激。我们的第一个研究目的是评估饲养环境变化后母猪的代谢和激素标志物，我们对急性期反应（AP）和氧化应激通路相关的蛋白也进行了分析。第二个研究目的是拓展2D-DIGE和iTRAQ标记蛋白组学技术的应用空间以寻找新的应激相关的血清标记。

2 方法

2.1 试验设计

试验材料为6月龄的后备母猪（长白×大白×杜洛克）60头，10头为一组。后备母猪被转移到单畜栏的第1天随意进食，每个畜栏大约饲喂2.5 kg的饲料。试验猪只分为两组，一组是HS组（n=15）在1 d（D1）、3 d（D3）、4 d（D4）、5 d（D5）对其进行采样（样品数为15乘4是60），该组母猪主要受到单畜栏饲养和重复取样两种应激；H组包括3个亚单位组，在3 d（n=15）、4 d（n=15）或5 d（n=15）对其进行采样（样品数为15乘3是45），接受单畜栏饲养和非重复取样两种应激，因此参与后期分析的样品数为105。这种设计使我们能区别重复取样和单畜栏饲养所产生的应激，不会干扰全进全出的管理模式。本试验设计中，第1天测量的参数对应于基础水平。

2.2 样本采集和准备

上午9点到11点通过颈静脉穿刺采取后备母猪的血样，并放在无抗凝血剂（血清）或含有EDTA-K3（细胞裂解物和脱蛋白血液）的管中。2 000 r/min离心10 min获得血清，离心后制备红细胞裂解液，用0.9%的NaCl洗涤细胞沉淀，用冷冻的去离子水裂解。将血液和5%偏磷酸混合，然后3 000 r/min离心5 min获取脱蛋白血液。通过使用小母猪自发咀嚼棉签30～60 s收集唾液样品，将棉签4 000 r/min离心10 min。所有离心均在室温下进行，将上清液冷冻在-80 ℃保存，直至分析。

2.3 参数分析

血清非酯化脂肪酸（NEFAs）、甘油三酯和胆固醇被确定为脂质代谢的标志物。血清总蛋白、尿素和肌酐被确定为蛋白质代谢的指标。用分析仪Olympus AU400测量代谢参数。所有的参数分析都进行重复分析。

2.4 免疫印迹

通过印迹法检测羰基蛋白质含量，通过免疫印迹检测血清载脂蛋白A-I（Apo A-I）。在两种免疫测定中使用对照样品来比较来自不同膜的结果。计算样品和对照蛋白条带之间的比率。

2.5 蛋白组学分析

通过2D-DIGE和iTRAQ对D1、D3和D5的血清样品混合进行发现蛋白质组学研究。

2.6 生化数据的统计分析

所有统计分析使用SAS系统V.9.1.3（SAS Institute，Cary，NC，USA）进行。对于所有生化分析，使用个体猪作为试验单位。当未指定时，显著性水平（α）设定为0.05。没有进行剔除异常值的测试。包括在统计分析中的变量是连续的。Shapiro-Wilk和Levene检验分别用于评价变量分布的正态性和方差齐性。选择非参数（Wilcoxon检验）来比较在D1（基础水平）和H和HS组的其余天数之间的所有测量参数获得的结果。使用H和HS组之间的非参数（Wilcoxon检验）进行重复取样对参数的影响。

3 结果

3.1 一般生化分析

结果显示：两组中在D3都观察到非酯化脂肪酸（NEFA）瞬时增加，在D4迅速恢复正常水平；在研究结束时甘油三酯（TG）显著增加；总胆固醇除了在HS组中D3增加之外，在其他时期没有变化；除了H组D5观察到较低水平的NEFA，在HS和H组之间没有观察到任何脂质标志物的差异。两组的尿素在D4和D5下降。两组中的肌酸酐在D3均增加，仅在H组D4和D5增加。在D3和D4转换到单畜栏后，血清总蛋白浓度增加。HS和H组之间没有差异。在血清中测量肌酸激酶（CK）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）酶活性并作为肌肉（CK和ALT）或肝损伤（ALT和ALP）的标志物。发现CK和ALT活性在个体间的变异很大。在HS组中观察到CK在D3增加。在血清和唾液中测定皮质醇作为应激标志物。该参数具有较大的个体间变异性，特别是在唾液中。

3.2 先天免疫系统和氧化应激防御监控

整个研究中H和HS组猪急性期反应蛋白水平发生变化，触珠蛋白（Hp）在D3稍微增加并且随后恢复到正常水平。C-反应蛋白（CRP）仅在HS组中D3增加，而在相同动物组中Apo A-I仅在D3处降低。H组和HS组改变饲养环境后氧化应激标记物发生了不同的变化：在H组中，谷胱甘肽过氧化物酶活性（GPx）在D4增加，超氧化物歧化酶（SOD）在D5增加，在tGSH和蛋白质-羰基中观察到轻微增加。HS和H组之间仅在D4和D5观察到GPx存在显著的差异，在D5观察到SOD存在显著差异。

3.3 蛋白组学分析

通过2D-DIGE和iTRAQ分析蛋白质组变化。结果表明：在H和HS组的D3和D5存在差异表达。

3.4 2D-DIGE

在H和HS组中的D3发现Hp，α1抗胰凝乳蛋白酶3和PRDX2显着增加，而Apo A-I显著降低。所有四种蛋白质在D5渐渐恢复到基础水平。

3.5 iTRAQ

8重iTRAQ分析鉴定了262种蛋白质。数据的总体分析反映了释放到血流中的细胞内蛋白质的轻微增加和许多细胞外蛋白质的相对减少（基因本体分析，数据未显示）。为了抵消这种蛋白质偏倚，对iTRAQ数据进行标准化。

在D3有67个蛋白减少，54个蛋白增加。大多数蛋白质在HS组中显示比H组更大的倍数变化，并且在D3比在D5产生更大的倍数变化。

在差异表达的蛋白质中，其中有两个蛋白在2D-DIGE分析也得到了：在D3和D5发现ApoA-I减少并且PRDX2增加。还通过iTRAQ鉴定了其他功能相关蛋白，例如载脂蛋白C-III，E，M和R（脂质转运）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）同种型3（抗氧化防御）。另一组具有相关功能的差异表达的蛋白质与免疫系统相关，包括乳铁蛋白，protegrin 3和半乳凝素1，其在H组和HS组中在D3增加，并且在D5恢复基础水平。最后，另一个相关的蛋白质组是细胞内蛋白质，如肌动蛋白结合蛋白，微管蛋白，参与糖酵解的酶和几个蛋白酶体亚基，这些蛋白在血清中水平增加。

4 讨论

在所有样品（样品数=105）中进行详细的生物化学分析，并且进行两种蛋白质组学方法用于鉴定该应激条件的新的潜在标记物。

生化分析表明小母猪在试验过程中是健康的。NEFA水平表明D3脂肪的脂质水平增加，而研究结束时两个动物组中的TG的增加表明后备母猪适应新的环境并且标准化它们的食物摄入。在蛋白质组学分析中也观察到脂质代谢的变化。这些观察结果证实改变的脂质代谢与生理应激相关，可能是受肾上腺素和皮质醇的脂解活性的结果。

应激，日粮的改变也可能会加速母猪蛋白质的分解代谢。由于血液提取过程中组织损伤可能会导致HS组骨骼肌标记CK增加。骨骼肌中含有丰富的CK和ALT，这两种物质之间存在强相关性（r=0.785）。关于氧化应激，H组的小母猪比HS组的小母猪具有更高的抗氧化活性。重复采血可能通过减少抗氧化剂防御或提高活性氧（ROS）来增加HS小母猪的氧化应激程度。

两种不同的蛋白质组学方法，表明HS组中的蛋白质组成比H组中的发生更大的变化，证明反复取样和居住环境/饮食改变的后备母猪会受到更大的挑战。

蛋白质组学还表明发生了一定程度的细胞损伤，导致血浆中细胞蛋白质的相对增加，例如肌动蛋白结合蛋白、微管蛋白、参与糖酵解的酶和几个蛋白酶体亚基。这些蛋白质中有些是潜在的优秀标记物，因为它们在血清中大量增加。由于单畜栏会减小空间，进而引起相关的物理损伤，可以增加细胞渗漏。有趣的是，已经报道过细胞质蛋白β-肌动蛋白是圈养中的应激生物标志物。然而，只有在更多数量的个体和不同的应激条件下对这些蛋白进行彻底的验证，才能被认为是足够的生物标志物。

在所有情况下（生化标记物和蛋白质组学结果），在H和HS组中观察到的血清分析变化发生相同的变化。HS组中所有的变化总是比H组的变化大，更加说明在受到两种类型的应激后后备母猪损伤更重要。

需要进一步的研究以确认差异表达的蛋白可以作为应激生物标志物，并表征其特异性，敏感性和代谢动力学。

5 结论

母猪饲养于单畜栏会促进其血清组成的相关变化，包括脂质、蛋白质分解代谢和氧化应激的增加，先天免疫系统的激活，可能引起组织损伤。因此，我们建议将血浆脂质标志物、APP或其他先天免疫指标、氧化还原成分、细胞内蛋白质和唾液皮质醇的综合信息作为猪福利的评判指标。

（原文作者及链接：Anna Marco-Ramell,Laura Arroyo,Raquel Pe a,Raquel Pato,Yolanda Saco,Lorenzo Fraile,Em ke Bendixen and Anna Bassols；http://bmcvetres. biomedcentral.com/articles/10.1186/s12917-016-0887-1）

2017-01-16）