针刺作用及机械力刺激对成纤维细胞的影响*

张小红,蔡定均,王 宇,黄士其

(成都中医药大学，成都 610000)

针刺作用及机械力刺激对成纤维细胞的影响*

张小红,蔡定均△,王 宇,黄士其

(成都中医药大学，成都 610000)

成纤维细胞作为穴区主要的感受性细胞和效应性细胞，在接受针刺的机械刺激后其细胞形态结构、周长和横截面积等均会发生规律性改变。同时机械力刺激还能促进成纤维细胞增殖、相关生长因子的合成与释放及细胞骨架重构等，这一系列变化的发生可能与力学效应激活成纤维细胞膜上的整合素和MAPK信号传导通路有关，从而导致机械力作用向生物化学信号的转换，由此推断成纤维细胞的改变在针刺的力传导途径中具有重要的研究意义。

针刺；机械力刺激；成纤维细胞；细胞骨架；丝裂原活化蛋白激酶

随着实验针灸学的发展和进步，穴位实质和针灸治疗机理的研究逐渐得到医学界的重视，已从穴位组织、细胞、分子深入到基因水平。关于筋膜结缔组织与针刺作用的相关研究也越来越受关注。穴区组织细胞在接受针刺作用后如何将机械刺激感知并转换为生物信号的过程，已成为近年较热门的研究方向。通过对针刺信号传导机制的研究，能更科学充分地阐明针灸治疗疾病的途径与机制，促进针灸在临床中的广泛应用与传承。针刺作用于穴位后，根据针刺部位和深度的不同可将接受刺激的部位分为真皮层致密结缔组织、皮下疏松结缔组织、肌间隔疏松结缔组织、神经血管束疏松结缔组织和器官门疏松结缔组织，其中后4种类型均属于非特异性结缔组织范畴，即筋膜结缔组织[1]。而成纤维细胞是疏松结缔组织中数量最多的细胞，主要由胚胎时期的间充质细胞分化而来，具有合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质等功能。其对局部张力变化非常敏感，是主要的感受性细胞和效应性细胞。因此，成纤维细胞在针刺的力信号传导中具有重要意义。

1 成纤维细胞形态改变与针刺作用的关系

细胞的形态结构是细胞功能代谢的物质基础，细胞形态的改变影响着细胞功能代谢的完成。针刺作为一种外界的机械刺激，可被穴位中的成纤维细胞感知，并引起成纤维细胞形态、突起、周长及横截面积等改变。通过针刺对穴位进行提插捻转时，组织位移可发生显著变化，尤其在捻转针体时组织位移可被扩大5倍[2]。这种组织牵拉导致了成纤维细胞在周长和横截面积方面发生显著时间、依赖性增长，牵拉组织中的成纤维细胞突起更短，“片状”细胞体积更大[3]。在激光共聚焦显微镜下，30%成纤维细胞的突起从一个细胞到另一个细胞是连续的[4]。同时，双向捻转针刺手法可引起成纤维细胞出现广泛的细胞扩展，形成大量板状伪足，在捻转两圈时该效应最明显，此时的针刺效应可被Rho激酶抑制剂和肌动球蛋白收缩等阻断[5]。通过针刺捻转手法刺激穴位时，针体对胶原纤维的牵拉可能引起针体周围大量成纤维细胞的可逆性收缩。该种收缩又可进一步牵拉胶原纤维，进而导致基质变形的“波浪”式传导，最终细胞收缩将针体机械力信号传导到整个结缔组织[6]。疏松结缔组织遍布全身，在体内形成一个连续的网络,包括皮下和周围间质结缔组织及渗透到肌肉和器官的结缔组织[7]，这可能是针刺循经感传的一种理论支撑。

成纤维细胞作为穴区主要的感受性细胞，对机械力刺激的感应非常敏感。筋膜组织成纤维细胞在受到压力刺激时，细胞形态由原来的梭形变为三角形，原本分布均匀的成纤维细胞间隙加大，细胞发生回缩，细胞形态缩小[8]。人牙周成纤维细胞在机械拉伸应变作用下，细胞形态和骨架均发生规律变化，细胞和细胞核投影面积与加压时间及应变值均呈正比[9]。骶韧带成纤维细胞在受到拉伸力加载后，结果显示加力前细胞形态多为长梭形或不规则三角形，排列呈多向性，无明显规律，随受力时间延长，形态成了单一的长梭形，排列方向趋于规则并垂直与最大应变方向，以加力24 h最明显[10]。而针灸的刺法，从微观角度分析其力学刺激主要表现为针体机械运动过程中针体与周围组织间的挤压力、摩擦力和牵张力作用[11]，由此推断，作为机械力刺激的一种，针刺作用亦能使穴区成纤维细胞发生相同的效应，为日后的研究提供了新的方向和思路。同时有研究发现，针刺引起成纤维细胞变形，进而影响撕裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等信号蛋白的表达，激发体内一系列生物效应[12]。可见，成纤维细胞在感受针刺等机械刺激及针刺信号传递中发挥着重要作用，预示了针刺的牵拉力和压力在结缔组织中传导的形式。

2 成纤维细胞骨架对针刺等机械刺激的响应

细胞骨架是一组由纤维状结构组成的，位于细胞浆和细胞核内的一类复杂的蛋白质纤维网状结构，广义的细胞骨架包括细胞外机制、细胞膜骨架、细胞质骨架和细胞核骨架，狭义的细胞骨架主要指细胞质骨架，分为微丝、微管、中等纤维以及微梁等结构。其功能为维系细胞体积和形态，参与细胞的力传导、胞内物质运输、细胞分裂和运动等，其表面含有大量负电荷，能结合多种机械敏感分子，并能调节受体介导信号分子传导和离子通道的运输。

针刺作为一种机械刺激，能对穴区组织产生挤压力、摩擦力和牵张力，这些力分别作用于细胞后，大部分是由微丝中的F-actin肌动蛋白骨架来相应。F-actin作为骨架微丝蛋白的主要成分，对细胞黏附、铺展、运动和内吞及分裂等具有重要作用[13]，因其与跨膜分子相连而成为跨膜信号传递的主要环节[14]。当F-actin受到非破坏性压力刺激时，会发生纤维解聚，纤维变细、变短，排列不一致，在加力12 h时有所恢复，破坏性压力刺激下F-actin解聚，微丝形态随加力时间延长而遭到不可逆破坏[15]。微丝中的肌动蛋白是决定细胞形态的最重要骨架蛋白，它通过与肌动蛋白集合蛋白发生反应以接受来自细胞外的刺激并做出应答，而α-辅肌动蛋白作为细胞骨架中重要的肌动蛋白结合蛋白，能使肌动蛋白丝和肌动蛋白束及肌动蛋白网架发生交联，使细胞骨架微丝进一步形成，在适应性力作用下α-辅肌动蛋白合成可持续增加[10]。

3 成纤维细胞整合素对机械刺激的响应

整合素主要由α、β 2个亚单位组成，是一类介导细胞-基质和细胞-细胞黏连的细胞表面受体。生物细胞力学研究表明，细胞外机制-整合素-细胞骨架是细胞力学信号传导的经典途径[16]。整合素作为跨膜蛋白在该信号通路中起到关键的“信号中转站”作用，主要介导细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互黏附，以及介导力学信号在细胞内外之间的双向传导[17]。压力是经络腧穴的有效刺激手段之一，压力刺激能促进筋膜成纤维细胞力感受器整合素分子α1亚基、α3亚基以及β1亚基的表达，筋膜成纤维细胞可通过β1亚基感受压力学刺激。研究发现，整合素β1对低中度强度的压力刺激强表达，对重度压力的刺激弱表达[18-19]，目前认为细胞骨架与信号分子结合部位主要是整合素β，α亚基只起调节作用。β亚基在机械力刺激作用下，其“膝部”弯曲以暴露基质结合位点，可活化细胞内的黏着斑和RhoGTP酶，调节细胞骨架构的构象及活化信号通路[20]。跨膜细胞黏附分子整合素是大多数细胞共有的、关键的力感受器分子，外界刺激可使其发生空间分子内应力变化，诱导某种活性结构或功能域的形成，促发生物化学级联反应，以完成力信号向生物化学信号的转化[21-22]。因此，整合素对机械刺激的这种响应是否能够由针刺作用激发，并以此揭示针刺的力信号在细胞中传递的机制，还有待进一步的研究来证实。

4 MAPK信号传导通路与细胞骨架的关联性

丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号通路是介导细胞力信号传导的重要途径，可被一些生长因子、细胞因子、炎症、渗透压改变及DNA损伤剂等激活。常见MAPK信号通路有细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、C-Jun氨基末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)、p38MAPK(p38 α,β,γ,δ)及ERK5、ERK7/8和ERK3/4[23]。这些信号通路能同时对微管、微丝和中间纤维等进行调节。对微管的调节主要有MAPK信号通路能使MAPs过度磷酸化而间接调节微管的稳定性，其中p38MAPK激酶可通过使钙离子结合蛋白中MAP14(S100A9)过度磷酸化来抑制MRP8/MRP14复合物引起微管多聚化[24]。MAPK对微丝的调节表现在：被激活的ERK、JNK和p38MAPK通路可引起微丝发生重排及细胞形态改变，其中p38MAPK和ERK通路还参与了微丝重排时细胞的迁移能力。而p38MAPK还能够通过影响微丝的完整性和稳定性调节细胞的凋亡和再分化[25-26]。MAPK信号通道对中间纤维的调节主要有：p38MAPK可通过影响角蛋白的磷酸化状态及其在胞内的聚合来调节细胞的形状[27]。同时p38MAPK/MK2通路还可促使小热休克蛋白家族中的Alpha B-crystallin蛋白磷酸化，从而调节中间纤维的稳定性[28]。研究发现，p38MAPK和JNK通过激活HSP27蛋白而增强细胞骨架的稳定性[29]。针刺可通过抑制皮肤组织p38MAPK和NF-kB的表达来降低MMP-1的生成，阻止细胞外基质成分降解而起到抗皮肤衰老的作用[30]。同时针刺作用能促进筋膜组织和脊髓节段中ERK1/2与p38MAPK的表达，这不仅说明针刺作用能激活MAPK通道，同时从侧面证实了针灸对人体的作用不仅能通过神经-体液调节，还可能存在一种较为原始的调控网络，即筋膜结缔组织支架可能在微观信号传递层面对局部细胞分化与增殖有着促进作用[11]。

5 其他

此外，针刺作用还可对成纤维细胞相关生长因子进行调节。陈波等[31-32]通过模拟毫针压力刺激作用对体外培养的大鼠“足三里”穴筋膜组织成纤维细胞施压后，结果表明压力刺激能调节筋膜组织成纤维细胞基质金属蛋白酶1(MMP-1)、基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)和前列腺素E2(PGE2)的合成与释放，并能提高MMP-1与TIMP1的比值。同时在200kPa压力刺激时，成纤维细胞干扰素-β(INF-β)含量显著降低，而肿瘤坏死因子(TNF-α)合成释放量明显增高。由此推断，毫针的机械刺激作用可能是通过调节穴区成纤维细胞相关生长因子的表达来转换成生物信号的。同时，通过电针刺激创伤大鼠创面尤其是负极在伤口正中时，能加速创面成纤维细胞及角化细胞生长因子的形成，从而促进伤口的快速愈合[33]。间歇性机械牵张力能促进人牙周膜成纤维细胞增殖，在1000ustrain和2000ustrain时表现明显[34]，而12%形变率、0.2 Hz频率的牵张力对人牙周膜成纤维细胞增值效果最佳[35]。

综上所述，当压力、牵张力等力学刺激作用于穴区后，可能通过影响成纤维细胞的数量、形态结构，改变成纤维细胞骨架中微丝的形态，促进成纤维细胞整合素及相关生长因子的表达，调节MAPK信号传导通路中的JNK、p38MAPK及ERK等信号通道，来实现机械力信号向生物化学信号的传导。提示成纤维细胞在力效应传导的过程中起着重要作用，尤其是细胞骨架作为连接介质，其发生改变是机械力信号传导的重要环节之一。由此推测，针刺作用属于力学刺激的一种，同样能通过以上方式将刺激作用转换为生物化学信号，传至全身起到治病救人的效果。但目前的研究多以理论推断和科学印证为主，其中又以模拟针刺力刺激的研究居多，如何通过对针刺力信号传导机制的进一步深入研究，揭示力信号在成纤维细胞中的传导规律，更全面地揭示针刺效应的产生与成纤维细胞骨架、MAPK信号通路及相关生长因子等之间的关系和机制，是未来研究中需要面对和克服的问题，这对于针灸临床效应的提高有着不容忽视的重要性。

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Effect of Fibroblasts Stimulated by Acupuncture and Mechanical Stress

ZHANG Xiao-hong, CAI Ding-jun△, Wang-Yu, HUANG Shi-qi

(ChengduUniversityoftraditionalchinesemedicine,chengdu610000,sichuan,china)

As the main receptor and effector cell of acupoint, the fibroblasts which stimulated by acupunture and some mechanical force will change in cellular forms,perimeter and cross-sectional area regularly. Acupuncture action is a kind of mechanical force，and the mechanical Strains can promote fibroblasts proliferation, compound and release some growth factors,even refactor cytoskeleton. This series of changes may be associated to the mechanical effect, and the integrin and MAPK signal transduction pathway of the fibroblasts can be actived by mechanical force.Thereby, this process results in mechanical force transform to biological chemical signals.It can be concluded that the change of the fibroblastse has important research significance in acupunture force signal transfer pathway.

Acupunture; Mechanical Strain; Fibroblasts; Cytoskeleton; MAPK

国家自然科学基金资助项目(81373559)-经穴反应性时间特征的嘌呤信号—成纤维细胞

张小红(1989-)，女，四川遂宁人，医学硕士，从事针灸时间效应及其机制的研究。

△通讯作者：蔡定均(1975-)，女，教授，硕士研究生导师，从事针灸时间效应及其机制的研究，Tel:13558620019,E-mail:1325581717@qq.com。

R224.1

A

1006-3250(2017)03-0380-04

2016-08-10