毛皮动物肺炎克雷伯氏菌分离菌株的系统发育及微胶囊疫苗的研制分析

2017-01-16王国明

中国畜牧兽医文摘 2017年3期

关键词：氏菌毛皮小白鼠

王国明

(昌乐县畜牧兽医局，山东昌乐 262400)

毛皮动物肺炎克雷伯氏菌分离菌株的系统发育及微胶囊疫苗的研制分析

王国明

(昌乐县畜牧兽医局，山东昌乐 262400)

肺炎克雷伯氏菌在以前并没有对畜禽造成严重的危害，对于该菌种的研究工作只停留在认识阶段。然而近几年由于抗菌药物的广泛应用，造成该菌种的耐药性大幅提升，出现多重耐药菌株，对于毛皮动物的危害也日益突显出来。在毛皮动物养殖环境不断变化的情况下，养殖业的科研人员需要对肺炎克雷伯氏菌的作用机理地进行深入的分析，为抗病疫苗的研发工作奠定良好的基础。

微胶囊疫苗系统发育肺炎克雷伯氏菌

克雷伯氏菌属于肠杆菌科，包括五个种，即变形克雷伯氏菌、变形克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌。其中产酸克雷伯氏菌与肺炎克雷伯氏菌两个菌种与动物和人类的致病性有关。当前我国毛皮动物养殖场普遍存在的流行疾病基本上有着比较一致的症状表现特征，然而相关的致病机理却十分复杂，需要对其进行深入的研究与分析。其中肺炎克雷伯氏菌广泛分布于自然界中，是定植于动物与人类肠道、呼吸道内的典型致病菌，可能引发创伤感染、支气管炎、肝脓肿、肠炎以及脑膜炎等疾病。对于毛皮动物来说，该菌会影响到毛皮质量，影响毛皮动物养殖的经济效益，本文对肺炎克雷伯氏菌的防控措施以及生物学生特性进行了详细的阐述与分析。

1 资料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

本次研究选取病死毛皮动物样本173例，其中包含66头份水貂、56头份狐狸以及51头份貉子。

1.1.2 菌株

从死亡毛皮动物中获取奇异变形杆菌与沙门氏菌并保存于实验室中；肺炎克雷伯氏菌样本来源为鸡源2株、猪源2株、貉源2株、狐源2株、貂源4株。

1.1.3 主要仪器

本次实验所选取的仪器为：UV-1100型可见分光光度计、PE-6800VET型全自动血细胞分析仪、高速胶体匀浆机、流式细胞仪。

1.2 实验样本

1.2.1 试验动物

270只清洁级昆明小鼠以及18只BALB/C小白鼠。

1.2.2 细菌分离培养

173份病死样本，即水貂、狐狸以及豹子的气管、肝脏与肺脏均接种新鲜兔血营养琼脂平板，每份脏器各接种平板2份，其中厌氧培养与氧培养各一份，将恒温箱内保存并对培养结果进行观察。

1.2.3 药敏试验

选取疑似肺炎克雷伯氏菌8株，于LB液体培养基中进行培养，再用药敏纸片于培养基表面进行覆盖，经过24h的培养后，对抑菌环直径进行测量。

1.2.4 人工感染试验

将所选取的全部分离菌置于肉汤中进行培养，经过20小时的培养后再对含菌量进行计算，待含菌量在1.4×109CFU/ml以上时，将BALB/C小白鼠样本平均分为对照组与实验组两组，取2ml生理盐水平均注射于对照组9例小白鼠样本中，另取0.2ml菌液平均注射于实验组9例小白鼠样本中。经过一周后，对所有研究样本的死亡情况与发病情况进行观察，对死亡样本进行解剖分析，并对细菌进行分离处理。

2 肺炎克雷伯氏菌微胶囊口服疫苗的制备

2.1 测定试验菌株

根据改良寇氏法来试验进行设计，取SPF级昆明小鼠60只，将其分为6组，前5组各注射0.2ml细菌，最后一组注射等量的生理盐水。对小白鼠死亡情况进行观察，再根据寇氏法计算对LD50指标进行计算。

2.2 制备全菌免疫原

在LB液体培养基中接种K1株，经过36h的培养，对细菌数量进行统计，调整菌液深度至150亿/mL，在完成灭活处理后再对其进行乳化操作，形成灭活苗。

2.3 提取OMP

利用Wooldridge法对肺炎克雷伯氏菌内部所包含的OMP进行提取，提取步骤主要包含：（1）K1菌株培养与震荡过夜；（2）离心处理并收集菌体，将菌体样本置于MgCl2溶液中，重悬一次；（3）通过超声波设备对细胞进行破碎处理，在通过离心处理清除破碎细胞与细胞核；（4）上清高速离心，将离心后的样本溶于Tris-MgCl2溶液中，再进行降解内膜蛋白处理；（5）溶液高速离心，沉淀操作完成后，利用缓冲液再悬浮；（6）悬液经透析后，将样本置于保温箱中备用。

2.4 制备微胶囊疫苗制

通过界面、喷雾配位法对疫苗进行制备，事先将海藻酸钠溶液倒入烧杯中，对其进行机械搅拌处理，在搅拌的过程中加入全菌体疫苗，利用高压枪向微胶囊固化器中喷入搅拌好的液体，在离心沉淀操作完成后，再进行4min的机械搅拌，用壳聚糖交联，最后将所配置的样品妥善保存起来。

2.5 肺炎克雷伯氏菌微胶囊疫苗特性

肺炎克雷伯氏菌能够造成家兔的肺炎以及肠炎，大熊猫的肝炎与腹泻等疾病，牛、竹鼠以及水貂等大量死亡。经过方面的调查研究发现，毛皮动物的流行疾病普遍有着极强的抗药性，需要用专门的新型疫苗对部分疾病进行防治。

通过光学显微镜对疫苗开关进行观察，对视野区域进行固定，经实验研究发现，本次实验所选取的视野范围内一共存在微胶囊298个，通过SPSS17.0软件对粒径正态分布曲线、分布范围与平均粒径进行分析。在对其进行电胶固定喷金处理后，通过扫描电镜对疫苗物理性状进行观察。