提高免疫组化染色质量的经验总结

阮顺爱 蔡爱英 林秀香

（福建莆田市第一医院病理科，福建 莆田 351100）

提高免疫组化染色质量的经验总结

阮顺爱 蔡爱英 林秀香

（福建莆田市第一医院病理科，福建 莆田 351100）

目的分析影响免疫组化染色质量的因素，总结提高染色质量。方法在免疫组化染色过程中，严格执行操作规范；标本及时充分的固定、组织的正确处理、合适的抗原修复和合理运用缓冲液和稀释液，保证染色试剂的有效浓度和有效期，合适的烤片温度和时间，正确的制片方法等。结果保存了组织抗原的免疫活性，极少出现非物异性背景染色和假阳性反应。结论认真对待免疫组化染色过程中的各个环节，避免不良现象发生，可获得满意的染色结果。

免疫组化；染色质量；总结

随着医学技术的飞速发展，疾病种类的不断变化，病理医师和临床医师对免疫组化的依赖性日益增加，免疫组化技术已列入日常操作，并广泛运用于临床，在病理诊断中起重要作用。但免疫组化在实际操作中受很多因素影响，任何一环节出现差错，都可能导致结果不准确，而导致诊断失误。作者通过实践总结出一些经验，介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料：材料均来源于我科日常工作的常规标本，按规范[1]操作及染色。

1.2 方法

1.2.1 严格执行临床病理操作规范，严格遵循中华医学会编著的《临床技术操作规范病理学分册》相关内容，并严格按照操作规范操作，采用SP法即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法。

1.2.2 标本的固定：用中性福尔马林固定液固定标本8～20 h。

1.2.3 组织的包埋、切片、烤片：常规石蜡包埋，切片，切片厚度2～3 μm。切片避免刀痕和组织折叠，并用防脱玻片，烤片温度60～62 ℃，拷片时间2～3 h。

1.2.4 抗原修复

1.2.4.1 切片常规脱蜡至水，用生理盐水或蒸馏水冲洗一次，再用PBS（0.01 mol/L，pH 7.4）冲洗液冲洗3次×3 min。

1.2.4.2 利用自动染色仪帮助监测抗体或试剂的有效成分，并保证试剂在有效期内。

1.2.4.3 滴加一滴3%甲醇双氧化溶液，室温下10 min，然后 PBS冲洗液冲洗3次×3 min。

1.2.4.4 抗原修复：需进行抗原修复的，据需要或将切片置于盛有柠檬酸盐缓冲液的高压锅内高压修复3 min；或用EDTA水浴加热10 min；或用胰酶或胃酶消化15 min，PBS冲洗液冲洗3次×3 min。

1.2.4.5 滴加第一抗体：置湿盒中4 ℃过夜，PBS冲洗液冲洗3次×3 min。

1.2.4.6 滴加第二抗体：置室温下15 min，PBS冲洗液冲洗3次×3 min。

1.2.4.7 DAB显色：滴加新鲜配制DAB溶液，镜下控制显色强度。

1.2.4.8 水洗，苏木素复染，中性树胶封固。

2 结 果

染色质量标志：阴性和阳性对照标准率均达到标准。

3 讨 论

3.1 免疫组化染色的意义：免疫组化在临床及病理诊断中已广泛应用，对疾病的判定、鉴别诊断及判定疾病的预后及临床医师对疾病的治疗具有重要的指导意义。严格做好免疫组化质量控制是提高病理诊断水平的重要里程碑。

3.2 严格执行临床病理操作规范：为提高免疫组化染色的准确率，病理工作人员在工作中应严格遵循中华医学会编著的《临床技术操作病理学分册》相关内容规定，如免疫组化的适用范围，不宜应用的范围等。并严格按照操作规范操作，并不断总结经验是提高免疫染色质量的先决条件[2]。

3.3 注意事项

3.3.1 组织固定要充分及时且不宜超过24 h，若固定时间过长，由于甲醛及组织蛋白间的交联等作用致使细胞的抗原决定簇被覆盖、丢失，影响其表达活性，但组织没有完全固定，则造成细胞溶解、抗原丢失。

3.3.2 烤片温度不宜过高（≤62 ℃），温度过高且时间＞4 h组织长时间暴露在高温下则可能出现边缘假象。因此当要显示低表达抗原时，烤片应该在37 ℃或室温下干燥过夜。

3.3.3 组织切片不宜过厚或过薄（2～3 μm），并尽量减少刀痕及组织折叠，否则易出现背景过深或特异性染色。

3.3.4 严格监控试剂的有效期和有效浓度。

3.3.5 自动化染色可最大程度减少操作程序上的错误，而手工染色要严格保持操作方法的一致性。

3.3.6 注意监控染色质量：每批染色后都应进行质量检查并作阴、阳性对照，尽量采用内对照，如用血管壁平滑肌是否着色来判断Actin着色是否成功。

4 假阴性着色原因

假阴性着色指组织中的抗原应该表达却没有着色。

4.1 脱蜡不完全：石蜡层会干扰甚至抑制抗体与抗原结合，需在二甲苯中彻底脱蜡，二甲苯和酒精应定期更换。

4.2 修复液不正确：不是所有抗原修复液溶液都适用于所有抗体，当抗原用EDTA修复最佳时，换用柠檬酸修复液有可能造成假阴性结果。

4.3 抗原热修复温度不够充分：没达到合适温度和规定时间，充分逆转固定可能无法实现。

4.4 酶修复过度：若组织被过度修复致其形态学破坏，则其抗原可能就不再与抗体结合，从而造成假阴性结果。

4.5 抗体浓度：抗体在4 ℃冷藏一段时间后效价会降低，并在某个时候会迅速下降以致产生阴性结果。

4.6 显色剂不相容：标准组合是HRP酶与DAB显色剂组合，核快红显色剂与BCIP/NBT起反应，只用于碱性磷酸酶。

4.7 步骤错误：如没按正常顺序或时间完成，试剂配制错误，仪器电脑出故障，试剂标签贴错，切片摆放错误等。

总之，进行免疫组化染色须有高度的责任心，严格执行操作规程，避免不良现象发生，经常做实验后总结工作，可提高免疫组化染色质量。

[1] 中华医学会.临床技术操作规范病理学分册[M].北京:人民军医出版社,2004:10-12.

[2] 2015全国卫生专业技术资格考试指导病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2014:10-101.

R446.6

B

1671-8194（2017）20-0033-02