冠心病血瘀证表观遗传学研究进展❋

陈 光，高嘉良，刘咏梅，王 阶△

(1. 中国中医科学院广安门医院，北京 100053； 2. 北京中医药大学，北京 100029)

【综述】

冠心病血瘀证表观遗传学研究进展❋

陈 光1,2，高嘉良1，刘咏梅1，王 阶1△

(1. 中国中医科学院广安门医院，北京 100053； 2. 北京中医药大学，北京 100029)

从表观遗传学研究探讨冠心病血瘀证的证候实质，主要包括DNA甲基化修饰和非编码RNA调控两个方面。DNA甲基化的调控方式具有整体、可逆、间接的特点，而非编码RNA的调节方式具有广泛、多样、复杂的特点。总体而言，表观遗传学调控的时间特异性和组织特异性明显，调节方式相对间接，充分体现基因遗传与环境的相互作用，其中渗透着中医天人相应、整体观的思想，为研究中医证候实质与中药作用机制提供了合作平台。

冠心病；血瘀证；表观遗传学；DNA甲基化；mircoRNA；综述

血瘀证是中医理论传统证候的重要组成部分，是中医临床各科常见的一种证候，也是冠心病(coronary heart disease, CHD)最常见的证型之一。而表观遗传学是研究基因的核苷酸序列在不发生改变的情况下，基因表达的可遗传变化，是后基因组时代生命科学领域的重要组成部分。随着中医药现代化的进程，近年来一些学者从表观遗传学水平研究探讨CHD血瘀证的证候实质，主要涉及DNA甲基化修饰、非编码RNA(noncoding RNA, ncRNA)调控与组蛋白修饰[1]等层面，为研究中医学证候本质提供了新的思路与方法，已成为目前研究的热点，因此本文对其研究进展进行综述。

1 DNA甲基化

1.1 甲基化研究基础

在真核细胞中，甲基化是由甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基主要转移到CpG双核苷酸序列的胞嘧啶第五位碳原子上。DNA甲基化修饰使DNA结合蛋白的部位，即DNA双螺旋凹槽的外形发生改变，从而导致与DNA结合蛋白的结合能力降低[2]，从而调节转录。在方法学上，待测样本的DNMT水平和甲基化CpG结合蛋白水平，分别对预测基因组甲基化水平和甲基化在调节转录方面发挥调节作用程度具有一定意义。从DNA甲基化水平研究中医证候本质，主要存在以下特色及优势。一是DNA甲基化本身是可逆的，并受环境因素改变的影响，这就使其在研究证候的时间特异性领域中占有一定的地位，并为中药干预甲基化程度提供了可能性；二是在脊椎动物中甲基化CpG在整个基因组中均有分布，这为研究中医药干预证候机制的整体性提供了依据；三是DNA甲基化调控基因表达存在影响转录因子的结合活性与甲基化结合蛋白抑制转录直接和间接两种机制，为研究中医药对症治疗与对证治疗打开了思路。

1.2 血瘀证DNA甲基化研究进展

在DNA甲基化一系列的研究方法中，根据mRNA差异表达谱结果、生物信息学分析并结合血瘀证病理机制以及参考基因启动子CpG岛的注释情况，选择性检测甲基化水平是目前血瘀证DNA甲基化的主要研究方法。王萍等[3]采用甲基化特异性PCR技术检测家系CHD血瘀证、家系健康人KLF5和低密度脂蛋白受体相关蛋白12基因启动子甲基化程度，结果发现2组该基因甲基化程度差异无统计学意义(P>0.05)。唐梅森等[4]运用焦硫酸测序技术检测16例CHD血瘀证和8例非血瘀证患者ER-α、Gp6、AGTRAP基因启动子区域的甲基化状态，发现2组Gp6、AGTRAP基因启动子区甲基化程度组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。向忠军等[5]运用高通量芯片技术检测3例CHD血瘀证和3例非血瘀证患者DES和CTNNB1启动子甲基化程度，发现该基因可能是CHD血瘀证的危险因素。黄海波等[6]运用芯片检测技术检测20例CHD血瘀证、20例非血瘀证ZEB2和CHL1启动子甲基化水平，结果显示ZEB2与CHD血瘀证存在相关性，而CHL1则无相关性。

1.3 甲基化研究思路展望

由于甲基化本身的特点与中医特色有着一种天然而隐约的联系，其研究思路较为广泛，以下仅谈两点展望。一是研究表明，DNA甲基化修饰的最终效应远远不止于调控基因表达，甚至可扩展到基因组印记、X染色体失活以及染色质结构修饰[7]。而基因印迹是一种决定是否表达由其来自父方或母方基因的现象，通过卵子和精子形成过程中DNA甲基化精细微妙的变化而实现。实际上，基因印迹是对来自父方和母方遗传物质的一种选择[8]，是在先天之精形成过程中适应性选择的机制之一，为先天之精作用后天的研究提供了思路，从而为诠释中医体质对疾病发生发展及证候演变的影响提供了研究基础。二是ncRNA可以通过调节DNMT的表达而调节DNA的甲基化，而相应的DNA甲基化亦可调控ncRNA的转录水平，因此ncRNA-DNA甲基化两个层次的相互调节网络，可能是中医药干预作用的连锁放大效应机制之一，也可能是中药作用的关键环节之一。

2 ncRNA

2.1 ncRNA研究基础

ncRNA是不编码蛋白质的功能性RNA分子。其中长度大于200nt的称为长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)，而长度小于200nt的称为短链非编码RNA(short noncoding RNA, sncRNA)，后者分为核内小RNA(small nuclear RNA, snRNA)、核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)、胞质小RNA(small cytoplasmic RNA, scRNA)、小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)和微RNA(micro RNA, miRNA)[9-11]。目前CHD血瘀证的研究主要涉及miRNA，一类含有20～24个碱基的ncRNA，可以与mRNA的3‘或5’非翻译区特异性结合，并借此调节蛋白质翻译[12]，即通过miRNA同靶mRNA中的互补序列配对而调控基因表达[13]。其相关研究可以利用芯片或测序技术对不同组样本进行差异miRNA筛选，并可通过热图、散点图、火山图直观的表示，再利用TargetScan或miRanda软件(Linux操作系统)或相关数据库对差异miRNA调节的靶基因进行预测，并对靶基因富集分析，分析其调节的信号通路。另外，还可以通过分析相关mRNA差异表达谱结果，利用相关软件预测可能对差异mRNA有调节作用的miRNA，再对预测的miRNA进行验证，从而进一步明确调节mRNA差异的相关机制。

2.2 ncRNA研究进展

虞桂等[14-15]利用miRNA高通量芯片技术，对5例CHD不稳定心绞痛血瘀证及5例健康对照患者进行差异miRNA表达谱分析。结果显示，23个miRNA上调，2个miRNA下调，并与mRNA差异表达谱结合进行生物信息学分析。结果发现，NOD样受体信号通路、凋亡通路、细胞因子和受体相互作用通路与不稳定心绞痛血瘀证密切相关。鲍岩岩[16]则使用TaqMan低密度芯片技术，对CHD血瘀证24 h大鼠模型的心脏组织进行差异表达miRNA的筛选，结果显示模型大鼠心脏组织中表达变化差异显著的有16个miRNA，其中12个上调，4个下调；通过生物信息学方法构建调节网络结合RT-PCR验证的结果发现，PIK3CD、PPP3CA、PPP3R1、CASP3、IL1A显著上调；构建miR-384-5p过表达和抑制的H9c2细胞模型，检测PIK3CD蛋白水平，发现miR-384-5p下调，PIK3CD蛋白表达上调；通过双荧光素酶报告基因分析miR-384-5p靶基因，并从细胞水平验证miR-384-5p对靶基因的影响，结果显示miR-384-5p可与PIK3CD的3’非编码区结合，验证了二者的靶基因关系。白瑞娜[17]利用高通量芯片技术，对CHD血瘀证、瘀毒轻证、瘀毒重证以及健康对照组患者各5例，筛选差异miRNA表达谱和差异lncRNA，结果显示has-miR-1228-3p、has-miR-3157-3p组间差异显著；血瘀证组差异表达的lncRNA为FR066195、TCONS_00017783等211条。功能学分析发现，差异miRNA参与免疫炎症反应、血小板活化等病理过程，差异lncRNA与炎症、免疫、细胞黏附等生物学过程相关，提示miRNA与lncRNA均参与了CHD血瘀证的发生发展过程。

2.3 ncRNA研究思路展望

miRNA具有明显的表达阶段特异性和组织特异性，且以多种形式存在于基因组中，但大多位于基因间隔区，其广泛性、多样性和复杂性提示其与中医证候实质的关系密切。其在进化中高度保守，且血液中相对稳定，是其有望成为证候生物标志物的基础。在动物细胞中，miRNA也是先由DNA转录成原miRNA(primary miRNA，pri-miRNA)，经过Drosha酶切加工后形成发卡结构的miRNA前体(miRNA precursor，pre-miRNA)，再经过Dicer酶环切后才形成miRNA成熟体，其后不翻译成蛋白，其作用机制包括翻译抑制、介导完全配对mRNA的降解、介导不完全配对的mRNA衰退、靶mRNA的翻译抑制以及正调控和去抑制。因此，其调节的下游作用包括通过mRNA而影响蛋白表达代谢通路，通过调节DNA甲基化而影响DNA转录，调节组蛋白构象而影响染色质状态等。由此可见，虽然调节网络涉及多个分子层次，但miRNA可能成为药物作用的关键靶点，通过与其他调节方式的相互作用实现“杠杆效应”。相比miRNA、lncRNA调控机制更为复杂和广泛[18]，其通过与miRNA、转录因子、表观遗传修饰因子相互作用，以及诱饵、支架、向导、增强等作用机制，在转录前水平[19]、转录水平[20]、转录后水平[21]多种层面上调控基因表达水平。而新兴的环状RNA(circular RNA，circRNA)，是通过外显子环化或内含子环化将3′和5′末端连接起来而形成闭合的共价环形结构，具有高度稳定性、高度保守性以及组织特异性以及时空表达特异性等特点，可与相应的miRNA发挥海绵作用，也可直接与相关蛋白质结果发挥调控作用，被研究者视为有望成为用于临床诊断、治疗敏感性预测及预后判断的新型生物标志物。在内源竞争性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)假说中，lncRNA与circRNA通过竞争性结合共有的miRNA结合位点彼此制约。可见，ceRNA网络更适合作为作用机制研究的切入角度。

3 表观遗传学研究展望

3.1 表观遗传学与中医药学

表观遗传学的某些特性与中医学的一些特点比较吻合，因此表观遗传学的研究方法对证候本质研究和中药治疗机制研究在思路上有很多启示。一是环境可以影响表观遗传标记，从而影响基因功能[22]。表观遗传学的研究思路体现在环境与自身的相互作用而导致基因表型的变化，这与中医证候发生发展时间特异性的理论基础一致，所以从表观遗传学层面阐释证候发生发展的机制前景良好；二是表观遗传学调控不仅能调节细胞的生命活动，而且能够在有丝分裂中遗传给子细胞，其遗传特性为研究中医治本和疗效持续的特点提供了新思路；三是相对于细胞内蛋白质直接相互作用而言，表观遗传学的调控相对间接，而表观遗传学调控最重要的作用特点之一就是可逆转[23]，这符合中医治疗双向缓和的特色，为研究中药作用机制提供新角度；四是在中药作用机理研究方面。HSIEH等[24]对3294种中药材中48 491个化合物进行研究，发现其中29.8%的中药处方作用机制与表观遗传调控和miRNA有关。在政府批准的200种中药复方中，99%的中药复方与表观遗传调控和miRNA相关，而君药最为显著。另外，中药的有效成分作为外源性miRNA也受到重视，其通过消化道进入血液，这些调控信息也许能够作用于人体的基因调控过程，可能成为中药的新作用机制；五是所有复杂生物的基因组是病毒和转座子入侵的潜在目标，人类基因组45%是由远古进入人体病毒DNA的遗留部分所演变[8]，基因组通过表观遗传相关的RNA沉默机制实现对入侵者特异性的免疫应答，而人体这个复杂系统与外界环境在基因水平交融中相互筛选、实现有序，与中医天人相应理论关系密切。

3.2 表观遗传方法学展望

复杂性疾病是多基因遗传和环境等因素相互作用的结果，而表观遗传学机制则能很好地体现环境和基因的交互作用[25]。但目前的相关研究尚存在数量和质量上的不足。首先，以中医药理论为指导与以分子生物学技术为支持是进行中医表观遗传学研究的基础。其次，作为证候生物标记物的研究，在考虑时间特异性和组织特异性的前提下，在获得大样本量标本的基础上，运用统计方法将样本分为训练组与测试组，通过单变量Cox回归方法，利用训练组数据分析血瘀证高风险与低风险相关基因，建立风险预测模型，再利用测试组进行验证模型的特异性和灵敏度。另外，作为机制研究，通过生物信息学方法构建调控网络，并设计细胞和动物层面的功能学验证必不可少，从而试图捕捉网络中调节的关键点即“网络靶标”[26]，为进一步阐释“表型网络-生物分子网络-药物网络”的病证方关系[27]和基因治疗提供依据。同时，中医药传统理论对于表观遗传学的研究也有重要的启示意义。中医理论经过数千年疗效的验证而积累了大量的客观“结果”，若借此“反推”表观遗传学规律与本质，也许更容易接近真实。而阴阳学说则提示表观遗传学研究中更应注意“失衡”的分子机制，而并非单一靶点的研究。挖掘中医药传统理论，为表观遗传学研究提供新思路，探索表观遗传调控的核心规律，这样可以使两个学科在更深层次上实现统一。

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ResearchProgressonBloodStasiswithCoronaryHeartDiseaseinTermsofEpigenetics

CHEN Guang1,2, GAO Jia-liang1, LIU Yong-mei1, WANG Jie1△

(1.Guang’anmenHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100053,China; 2.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Researching the essence of Blood Stasis Syndrome in Coronary Heart Disease in the field of epigenetics mainly involves DNA methylation and non-coding RNA. The mechanism of DNA methylation regulation is integral, reversible and indirect, while the mechanism of non-coding RNA regulation is comprehensive, sundry and complicated. Overall, the regulation in epigenetics has obvious specificity in time and space and it is relatively indirect. It reflects the interaction between genes and environment and the thought ofcorrespondencebetweenheavenandhumankindandconceptofholism, which provides a chance for studying the essence of TCM syndrome and mechanism of Chinese medicinal.

Coronary heart disease; Blood Stasis Syndrome; epigenetics; DNA methylation; microRNA; Review

R541.4

A

1006-3250(2017)09-1336-04

国家自然科学基金面上项目(81473561)-冠心病血瘀证相关miRNA表达的甲基化调控机制研究；国家科技部“重大新药创制”重大科技专项(2013ZX09301307)-宣痹安痛方药物研发

陈 光(1991-)，男，住院医师，在读博士，从事中西医结合防治心血管疾病的临床与研究。

王 阶，男，主任医师，教授，博士研究生导师， 中国中医科学院首席研究员，Tel:010-88001817,E-mail:wangjie0103@126.com。

2017-03-17