中度系统性红斑狼疮与自身抗体的相关性研究*

张 颖，白 力，尹学红，王永福

(包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头014010)

中度系统性红斑狼疮与自身抗体的相关性研究*

张 颖，白 力，尹学红，王永福

(包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头014010)

目的:研究亚型干扰素-α(interferon-α，IFN-α)2b自身抗体在系统性红斑狼疮患者(systemic lupus erythematosus，SLE)患者血清的表达以及疾病的相关性。方法:采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测SLE患者、健康体检者血清内抗IFN-α 2b抗体的水平，并分析在SLE患者中上述抗体与临床指标和实验室检查的相关性。结果:中度SLE患者的血清抗IFN-α2b抗体高于健康体检组(P＜0.01)。SLE患者的血清抗IFN-α 2b抗体与患者临床指标和实验室检查具有相关性。结论:与健康对照组相比在中度SLE患者血清中抗IFN-α 2b抗体升高，提示抗IFN-α 2b抗体可能参与SLE的发生。

系统性红斑狼疮;抗IFN-α 2b抗体;自身免疫性疾病;自身抗体;免疫性炎症

抗细胞因子抗体在自身免疫性疾病的发病机制中起到了很重要的作用，在系统性红斑狼疮患者(systemic lupus erythematosus，SLE)的患者中也发现了抗细胞因子的自身抗体的存在，而且细胞因子的自身抗体水平和临床表现以及实验室指标都具有明确相关性。但是有趣的是在正常人个体中也存在着细胞因子的自身抗体，自身抗体的稳态似乎调节着免疫反应的过程。SLE是由自身免疫介导的，以免疫性炎症为突出表现的弥漫性结缔组织病。血清中出现以抗核抗体为代表的多种自身抗体和多系统受累是SLE的两个主要临床特征。通常用SLE疾病活动指数(disease activity index，DAI)积分的多少作为判断SLE病情轻重程度的评估。SLEDAI积分小于10分为轻型SLE，SLEDAI积分在10到14分之间为中度活动型狼疮，SLEDAI积分大于等于15分为重型SLE。本次的实验主要着手于系统性红斑狼疮患者和健康对照组血清内抗IFN-α 2b抗体的检测，并且评估这种自身抗体是否与患者的临床表现及实验室特征是否相关，从而探讨抗IFN-α 2b抗体与系统性红斑狼疮疾病进程的关系，进而更加全面的了解系统性红斑狼疮患者的发病机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 SLE患者与健康个体的血清样本采集及保存

SLE血液采自2006年6月至2012年12月包头医学院第一附属医院风湿免疫科住院的114例确诊SLE患者，均为初诊、未接受糖皮质激素和免疫抑制剂治疗、病情处活动期患者，收集血清并记录临床症状及指标。病人的血清被存放在-80℃冰箱内。所有患者均符合2002年关于SLE修订的欧洲分类标准。健康个体血液采自285名包头医学院第一附属医院门诊健康体检者，并排除了血常规、肝功、肾功、血糖异常者。采集入选SLE病人外周静脉血5 mL，3 000转/min离心分离血清，编制号码存入血清库，-80℃冰箱保存进行抗IFN-α 2b抗体检测。

1.1.2 主要仪器见表1。

表1 主要仪器及生产厂家

1.1.3 主要药品及试剂见表2。

表2 主要药品试剂及生产厂家

1.2 方法

1.2.1 包被 用0.1 mol/L pH8.6碳酸氢钠包被缓冲液将人类重组IFN-α 2b稀释至1 μg/mL，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加100 μL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用5‰磷酸缓冲盐吐温溶液(phosphate buffer saline with Tween-20，PBST)洗涤缓冲液洗3次，每次3 min。

1.2.2 封闭 每个聚苯乙烯板的反应孔中加入封闭液(5 g/L的PBST+50 g/L脱脂奶粉)300 μL，37℃封闭2 h。

1.2.3 加一抗 弃去孔内溶液，加用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)以1:500稀释SLE病人和健康体检者血清100 μL，室温孵育2 h。用5‰PBST洗涤缓冲液洗6次，每次3 min。

1.2.4 加二抗 弃去孔内溶液，加用PBS以0.5 μg/mL稀释的辣根过氧化物(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗人抗体(二抗)100 μL，室温孵育1 h。用5‰PBST洗涤缓冲液洗8次，每次3 min。

1.2.5 加入2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐 室温避光孵育30 min，后读取405 nm的吸光度(A405)值。

1.3 实验室指标的测定 抗IFN-α 2b抗体采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测，补体C3、C4、免疫球蛋白(IgG/IgA/IgM)、C反应蛋白(C-reactionprotein，CRP)均采用免疫散射浊度法检测，红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)采用魏氏法检测。

1.4 统计学方法 实验数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。Cutoff值的计算用敏感性与特异性之和最高值对应的405 nm处的吸光度值。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用t检验，非正态分布的计量资料以中位数(四分位数间距)表示，组间比较采用U检验，计数资料用例数(率或构成比)表示，组间率的比较采用χ2检验，两变量之间相关性分析采用Spearman相关性分析P＜0.05(均为双侧检验)表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SLE患者数据统计 入选的SLE患者共114病程人，女106人、男8人，SLE中度患者30人，女29人、男1人，平均年龄(39.63±11.15)岁，平均病程(4.13± 4.99)年，CRP(17.70±35.76)mg/dL，尿蛋白定量(0.96 ±1.12)g，ESR(43.50±39.14)mm/h，IgG(14.87± 8.14)mg/mL。

2.2 各组血清抗IFN-α 2b抗体水平 SLE患者轻度、中度、重度组和健康对照组血清抗IFN-α 2b抗体水平分别为(0.875 0±0.433 5)，(0.941 9±0.439 1)，(0.814 4±0.383 8)，(0.745 3±0.332 4)，其中中度组高于健康对照组，有统计学意义(P＜0.001)。具体结果见图1。

2.3 抗IFN-α 2b抗体阳性组和阴性组的对比 抗IFN -α 2b抗体阳性和阴性 SLE患者在年龄、病程、IgA、IgM、CRP等指标上差异均无统计学意义(P＞0.05)，但在IgG、ESR、血管炎上差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 抗IFN－α 2b抗体阳性组和阴性组在临床表现和实验室检测中的对比

2.4 相关性分析 在进行相关性比较分析后发现，中度SLE患者抗IFN-α 2b抗体与尿蛋白定量呈负相关，差异有统计学意义(r=-0.585，P＜0.05)。结果见表4。

3 讨论

人们早在几十年前就发现机体能够产生抗细胞因子的抗体，并且这些抗体在正常人、自身免疫性疾病患者、感染性疾病患者、肿瘤患者等体内都被发现过。由于辅助性T细胞是高亲和力IgG抗体产生所必需对的，因此T细胞对细胞因子耐受的消失可能与自身抗体的产生有关。慢性或反复的感染，或者是T细胞但对天然细胞因子上表位的耐受性的永久性消失，或许可以解释这些自身抗体的持续产生。

表4 血清抗IFN－α 2b抗体与中度SLE患者临床及实验室指标的相关性分析

虽然证明了机体可以产生这些高亲和力的抗体，但是这些抗体的生理学和临床机制仍然不是很清楚。自身抗体在体外均可特异性地中和相应的重组和天然的细胞因子，而抗IFN-α自身抗体可在体内中和IFN-α。研究发现，自身免疫性疾病病人体内可以产生多种抗细胞因子的自身抗体。当首次在SLE患者体内发现抗IFN-α的自身抗体之后，人们又陆续在RA、SLE、SSc、混合性结缔组织病等患者体内发现了自身抗体［1］。这些自身免疫性疾病中抗细胞因子抗体多为IgG和IgM型。在不同类型的自身免疫性疾病中，同种的自身抗体的滴度变化较大。

细胞因子自身抗体可能通过一定的反馈机制参与到了免疫反应的调控的过程当中，自身抗体在早期会随着细胞因子的升高而升高，但是当细胞因子自身抗体超过某个阈值后，就会在某一个水平持续一段时间并最终开始回落［1］。这一特殊的现象存在于很多自身免疫性疾病中，因此，很多自身免疫性疾病中，抗细胞因子抗体可以被当做一种很好的生物标记物，用于检测患者的疾病活动度［2-4］。

在我们的研究中发现，中度SLE患者组与健康对照组相比，抗IFN-α 2b自身抗体显著升高，尤其是中度SLE组，差异有统计学意义。这表明在系统性红斑狼疮患者体内，抗IFN-α 2b自身抗体可能在系统性红斑狼疮的发病过程中起到了一定的作用。为了进一步确定抗IFN-α 2b抗体在系统性红斑狼疮中的作用，我们用cutoff值将SLE病人分成自身抗体阳性和自身抗体阴性两组，分别研究了这两组病人抗细胞因子抗体与临床表现和实验室特征之间的关系。统计分析后发现中度SLE患者组中IgG、ESR、血管炎上抗IFN-α 2b阴性和阳性个体是有显著的差异，并有统计学意义，并且在随后的相关性分析中发现，抗IFN-α 2b抗体与SLE患者的IgG和ESR也是具有相关性，且具有统计学意义。血管生成因子可刺激血管内皮细胞放电或分泌血管生长因子如血管内皮生长因子，引起血管内皮的炎性病变。在SLE患者中血管生成因子高度表达，并且和IgG、ESR成正相关，这些与我们的研究结果是一致的［5］。

以上结果提示我们IFN-α 2b的自身抗体，在SLE中有一定的特异性，可作为临床上诊断SLE的一个新的实验指标，并且与疾病活动及病情严重程度相关，可能有助于提高SLE的诊断率所以，深入研究抗IFN-α 2b的自身抗体将有助于我们深入探索SLE的发病机制及拓展SLE诊断和治疗的新领域。

［1］ Cappellano G，Orilieri E，Woldetsadik AD，et al.Anti-cytokine autoantibodies in autoimmune diseases［J］.American journal of clinical and experimental immunology，2012，1 (2):136-146.

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［3］ Steiner G，Smolen J.Autoantibodies in rheumatoid arthritis and their clinical significance［J］.Arthritis research，2002，4 (Suppl2):1-5.

［4］ Leng RX，Pan HF，Chen GM，et al.IL-23:a promising therapeutic target for systemic lupus erythematosus［J］.Archives of medical research，2010，41(3):221-225.

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Study on correlation between moderate systemic lupus erythematosus and autoantibodies

ZHANG Ying，BAI Li，YIN Xuehong，WANG Yongfu
(First Affiliated Hospital of Baotou Medical College，Baotou014010，China)

Objective:To study the serum expression of interferon-α(IFN-α)2b autoantibody in the patients with systemic lupus erythematosus(SLE)and its correlation with the disease.Methods:Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)method was adopted to detect the serum levels of IFN-α 2b aotoantibody in SLE patients and the healthy controls.The correlation analysis was made between the antibody in SLE patients and the clinical indicators and laboratory examinations.Results:IFN-α 2b aotoantibody in moderate SLE patients is significantly higher than that in the healthy controls(P＜0.01)and is related to clinical indicators and laboratory examinations.Conclusion:Serum expression of IFN-α 2b aotoantibody in moderate SLE patients increased compared with that in the healthy controls，suggesting that IFN-α 2b aotoantibody may be involved in the pathogenesis of SLE.

Systemic lupus erythematosus;IFN-α 2b aotoantibody;Autoimmune diseases;Autoantibodies;Immune inflammation

2015-10-15)

国家自然科学基金资助项目(81360464)

王永福