肠道菌群及其代谢产物与动脉粥样硬化的研究进展

刘红宏综述，胡晓敏、田然、曾勇、张抒扬审校

综述

肠道菌群及其代谢产物与动脉粥样硬化的研究进展

刘红宏综述，胡晓敏、田然、曾勇、张抒扬审校

肠道菌群的组成、结构变化与心血管疾病的发生、发展有着密切关系。近年来研究发现依赖菌群的代谢产物氧化三甲胺诱发动脉粥样硬化的发生，并与主要不良心血管事件明显呈正相关。本文就肠道菌群参与调控的元代谢途径与动脉粥样硬化之间的作用机制及研究进展进行阐述。

肠杆菌科；动脉粥样硬化；心血管疾病

动脉粥样硬化（AS）是众多心脑血管疾病共同的病理基础，严重危害人类健康。据《中国心血管病报告2015》[1]，我国心血管疾病(CVD)患病率及死亡率仍处于上升趋势。现有的研究都认为AS是一个复杂的代谢紊乱过程，其发生和发展是在遗传和环境因素的基础上，由多重危险因素共同作用导致的[2]。近年来许多大规模全基因组关联分析（GWAS）在寻找遗传变异方面进行了广泛研究，但其结果只能解释小部分的发病机制[3]。遗传学对探索病因的贡献无疑将随时间增加，但环境暴露在疾病发展过程中所起到的作用是不容忽视的，尤其是膳食摄入[4，5]。随着对肠道菌群研究的逐步深入，发现肠道菌群及其代谢产物可能通过促进AS的发生发展，成为心血管疾病的又一危险因素。

1 肠道菌群概述

人体是由真核细胞与体内共生的微生物共同组成的“超级生物体（Superorganism）”，而这些微生物的全部基因信息，则被称为“人体元基因组（Human metagenome）”[6]，其基因总数至少是人自身基因数目的150倍[7]。肠微生物与宿主之间进行密切的信息交流，在代谢、免疫、神经系统调控中都起到重要作用，维持着自身与人类宿主之间微妙的平衡[8]。

2 依赖菌群的代谢产物氧化三甲胺（trimethylamine-N-oxide，TMAO）

2.1 TMAO简介

肠道菌群变化影响宿主的代谢表型，主要体现在生物流体例如尿和血浆的组成变化。代谢组学的发展使我们能更好的捕捉微生物-宿主间的相互作用。近年来广泛受到人们关注的就是三甲胺（TMA）及TMAO[9]。Wang等[10]在大规模行冠状动脉造影的患者中筛选CVD标记物时，发现胆碱、TMAO和甜菜碱，这3种物质不仅同在食物来源磷脂酰胆碱代谢通路上，且其代谢必须依赖肠道菌群参与，且血浆TMAO浓度与3年随访期间主要不良心血管事件（MACE）的发生率呈正相关。随后另一项研究表明，L-肉碱，一种主要来自肉、鱼和乳制品的非氨基酸类条件性必需营养素，长期以来被认为是能够改善血糖和血脂水平的补充品，能被大肠内的细菌代谢产生TMAO，并在大型独立队列（n=2 595）中得到了验证[11]。进一步研究发现L-肉碱向TMA转化过程的中间体γ-丁酰甜菜碱 ( γ-butyrobetaine，γBB)，也可以作为TMAO产生的替代途径，并且比直接转化效率高1 000倍[12]。

2.2 TMAO代谢途径

具有TMA结构的膳食营养物通过特定的微生物酶（TMA裂解活性）转化为TMA，随后被宿主吸收，经肝脏中单加氧酶3（FMO3）作用转化为TMAO，最终经肾脏排出[13]。到目前为止，已经鉴定了2种不同的微生物酶系统，cutC（催化多肽）及其伴侣cutD（调节多肽）选择性地使用胆碱作为底物并释放TMA[14]；类似地，微生物加氧酶（CntA）与微生物还原酶（CntB）复合选择肉碱作为底物并形成TMA[15]。FMO3是FMO酶家族中活性水平最高的成员，其表达受性别和胆汁酸调控，是TMAO形成的关键酶。胆固醇喂养的小鼠中敲低FMO3会改变胆汁分泌，钝化肠胆固醇吸收；同时活化肝脏X受体而加重内质网应激和炎症反应。胰岛素抵抗小鼠FMO3敲低可以抑制高血糖，高脂血症和动脉粥样硬化的发展。这可能解释了胰岛素抵抗和CVD之间的关联机制[16]。在无菌小鼠实验中观察到了主动脉斑块负荷减轻，给无菌小鼠喂食肉碱后TMAO水平无显著升高，但在肠道细菌定殖后，即使喂食正常食物血浆TMAO水平也会随之升高，人类试验产生了类似的结果[10，11，17]，这些都证明了肠道菌群在代谢途径中导致AS形成的重要作用。

2.3 TMAO—心血管疾病的又一独立危险因素

近年来，许多队列研究想要探索TMAO水平与粥样硬化主要不良事件的关系。在大型独立临床队列（n = 4 007）表明TMAO处于最高四分位数的人群与最低四分位数相比发生MACE的风险增加了2.5倍[17]。颈动脉粥样硬化患者（n = 264）的血清γBB和肉碱水平相比于健康人明显升高，且在调整年龄和估计的肾小球滤过率后，高水平的γBB与心血管死亡率仍相关[18]。来自加拿大的多种族人群试验也证实了TMAO与流行心血管危险因素的相关性[19]。通过对稳定性冠状动脉疾病患者（n = 2 235）进行随访， 观察到TMAO水平升高预示5年全因死亡风险[20]。通过与冠状动脉病变SYNTAX评分的关联分析，TMAO还能用来评估冠心病斑块负荷程度[21]。在糖尿病人群中，TMAO与死亡、心肌梗死、不稳定性心绞痛、心力衰竭（心衰）等终点事件都相关；而在无糖尿病人群，TMAO只与死亡和心衰相关[22]。这些研究更加证实了TMAO可能成为CVD的又一独立危险因素。并且可在通过传统危险因素和血液检测无法识别的人群中作为预测未来心脏病发作、卒中和死亡风险的一种准确筛查工具。

3 AS人群的菌群测序分析

AS患者的肠道菌群组成中含有更多的Collinsella，而正常对照组中含有较多的Roseburia和Eubacterium。宏基因组检测进一步表明，患者肠道编码肽聚糖合成的菌群基因丰度上升而编码八氢番茄红素脱氢酶的基因相对减少，同时患者血清β-胡萝卜素水平也有所降低[23]。Koren等[24]使用16S rRNA方法来调查15例患者的AS斑块，口腔和肠道细菌，发现斑块中的Veillonella和Streptococcus的组成丰度与它们在口腔中的丰度相关。且使用qPCR检测显示其细菌DNA的量与炎症水平相关。Kelly等[25]通过建立不同的模型对与终身的CVD风险相关的个别种属进行了检测，发现与低心血管风险的患者比，高心血管风险的患者有四个种属（Prevotella 2、Prevotella 7、Tyzzerella和Tyzzerella 4）含量丰富；两个种属的细菌（Alloprevotella和Catenibacterium）基本不存在。

4 肠道菌群促进AS发生的可能机制

4.1 TMAO的“直接”影响

TMAO可以通过促进脂质流入，增强原位脂质合成，并抑制脂质清除。当给ApoE-/-小鼠喂食TMAO时，两种巨噬细胞清除受体CD36和SR-A1的表达水平增加，从而形成富含脂质的泡沫细胞，而口服抗生素能够抑制该现象[10]。此外，TMAO减少巨噬细胞胆固醇逆转运，这也是促进AS的重要机制[11]。Zhu等[26]发现TMAO可以直接影响血小板功能，并增加血栓风险。当血小板直接暴露于高水平的TMAO中，细胞内贮存Ca2+释放，这增强了多种激动剂（凝血酶，二磷酸腺苷或胶原蛋白）依赖的血小板活化能力。在无菌小鼠中进行的粪便移植能够“转移”血栓形成的高风险，这一点揭示了一个全新的冠心病患者发生血栓事件的机制[26，27]。

4.2 依赖肠道菌群的“间接”代谢机制

肠道微生物来源的短链脂肪酸（SCFA），主要由乙酸，丙酸和丁酸组成，能够激活外周脂肪组织中的G蛋白偶联受体（GPR41和GPR43），抑制胰岛素信号传导，调节胰岛素敏感性，从而控制能量利用[28]。胆汁酸在促进脂类消化吸收和胆固醇平衡调节中具有重要作用，肠道微生物衍生的次级胆汁酸通过激活多功能核受体，调节肝脏中成纤维细胞生长因子15和胆固醇7α-羟化酶（CYP7A1）的表达，抑制胆汁酸合成[29]。这些关于生理机制的研究把肠道菌群和肥胖，高脂血症和糖尿病这些冠状动脉疾病的风险因素联系起来。

4.3 肠道菌群相关的炎症机制

随着肠道屏障功能的减弱，少量的细菌内毒素可以进入血液中从而引起慢性全身低度炎症状态，通常被称为“代谢性内毒素血症”[30，31]。来自肠道的内毒素被Toll样受体4识别结合后，直接促进内皮损伤，引起单核细胞迁移分化成巨噬细胞，诱导斑块形成[32]。最新发现，生理水平TMAO注射诱导内皮细胞和血管平滑肌细胞相同的炎症标志物的基因表达，通过激活丝裂原活化蛋白激酶细胞外信号相关激酶和核因子κβ，TMAO还能够招募白细胞黏附[33]。

5 未来的治疗靶点

近年来的研究发现，可以通过干扰饮食、调节肠道菌群、改善代谢产物来为治疗冠心病提供新的手段。改变饮食无疑是最简单而且安全的干预方法， David等[34]的研究表明短期膳食干预可以显着改变肠道的微生物群。之前认为一些抗生素能通过抑制菌群来发挥治疗冠心病的作用，然而许多使用抗生素进行二级预防的临床试验都失败了[35]。一个更有前景的预防及治疗CVD的手段是使用益生元或益生菌。益生元主要包括摄取营养物或膳食成分，为“有益”细菌的生长提供优势。益生菌治疗涉及摄入一种或多种活的细菌菌株，尝试利用微生物的共生和潜在的水平基因转移以使宿主受益[36]。鉴于FMO3是产生TMAO 的关键酶，所以人们设想是否可以通过抑制FMO3酶的活性来减少TMAO的产生，有趣的是，在一种常染色体隐性疾病鱼气味综合征的患者中，由于FMO3基因的突变导致患者排出具有强烈鱼臭味的三甲胺尿[37]。所以FMO3抑制剂不是一种可行的药物靶标。研究人员试想将一种结构上与胆碱类似的3，3-二甲基丁醇（3，3-dimethyl-1-butanol，DMB）作为靶点。DMB是TMA裂解酶的强效抑制剂，抑制培养微生物中TMA的形成，且DMB抑制了动物模型中AS的发生。创新之处在于抑制的仅仅是物质的转化途径，而不是杀灭微生物[38]。总之，人体基因组是极难干预的，因此改变人体肠道微生物构成将成为疾病防治上新的突破口，成为CVD防治上新的靶点。

6 小结

很多研究还表明了TMAO与糖尿病、高血压、心衰、慢性肾功能障碍等一系列循环代谢疾病的关系[39-41]。肠道微生物通过从膳食底物产生代谢中间体来影响宿主生理状态的概念逐渐清晰。因此，我们还需要联合代谢组学技术与动物模型平台，运用“科赫法则”策略，探索肠道菌群与慢性代谢疾病的关系。目前，仍有一些问题需要深入研究，比如采取受试者治疗前后的连续样品将为进一步检测代谢产物的生物变异型和为治疗效果提供证据；目前尚未发现遗传对TMAO的影响，所以可能存在影响TMAO产生和消除的多个元生物位点；探索人群饮食、药物和生活方式对菌群的影响研究还需要更完善、可信的数据。关于揭开肠道菌群及其代谢产物作用机制的面纱，还需要我们更深入的研究。

[1] 陈伟伟, 高润霖, 刘力生, 等. 《中国心血管病报告2015》概要. 中国循环杂志, 2016, 31: 521-528.

[2] 高润霖. 冠心病疾病负担—中国出路. 中国循环杂志, 2017, 32: 1-4.

[3] Kathiresan S, Voight BF, Purcell S, et al. Genome-wide association of early-onset myocardial infarction with single nucleotide polymorphisms and copy number variants. Nat Genet, 2009, 41: 334-341.

[4] Brown JM, Hazen SL. The gut microbial endocrine organ: bacterially derived signals driving cardiometabolic diseases. Annu Rev Med,2015, 66: 343-359.

[5] Tang WH, Hazen SL. The contributory role of gut microbiota in cardiovascular disease. J Clin Invest, 2014, 124: 4204-4211.

[6] Zhao L. Genomics: The tale of our other genome. Nature, 2010, 465:879-880.

[7] Qin J, Li R, Raes J, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature, 2010, 464: 59-65.

[8] Tremaroli V, Backhed F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature, 2012, 489: 242-249.

[9] Griffin JL, Wang X, Stanley E. Does our gut microbiome predict cardiovascular risk? a review of the evidence from metabolomics. Circ Cardiovasc Genet, 2015, 8: 187-191.

[10] Wang Z, Klipfell E, Bennett BJ, et al. Gut flora metabolism of phosphatidylcholine promotes cardiovascular disease. Nature, 2011,472: 57-63.

[11] Koeth RA, Wang Z, Levison BS, et al. Intestinal microbiota metabolism of L-carnitine, a nutrient in red meat, promotes atherosclerosis. Nat Med, 2013, 19: 576-585.

[12] Koeth RA, Levison BS, Culley MK, et al. gamma-butyrobetaine is a proatherogenic intermediate in gut microbial metabolism of L-carnitine to TMAO. Cell Metab, 2014, 20: 799-812.

[13] Tang WH, Hazen SL. Microbiome, trimethylamine N-oxide, and cardiometabolic disease. Transl Res, 2017, 179: 108-115.

[14] Craciun S, Balskus EP. Microbial conversion of choline to trimethylamine requires a glycyl radical enzyme. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109: 21307-21312.

[15] Zhu Y, Jameson E, Crosatti M, et al. Carnitine metabolism to trimethylamine by an unusual rieske-type oxygenase from human microbiota. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111: 4268-4273.

[16] Miao J, Ling AV, Manthena PV, et al. Flavin-containing monooxygenase 3 as a potential player in diabetes-associated atherosclerosis. Nat Commun,2015, 6: 6498.

[17] Tang WH, Wang Z, Levison BS, et al. Intestinal microbial metabolism of phosphatidylcholine and cardiovascular risk. N Engl J Med, 2013,368: 1575-1584.

[18] Skagen K, Troseid M, Ueland T, et al. The Carnitine-butyrobetainetrimethylamine-N-oxide pathway and its association with cardiovascular mortality in patients with carotid atherosclerosis.Atherosclerosis, 2016, 247: 64-69.

[19] Mente A, Chalcraft K, Ak H, et al. The relationship between trimethylamine-N-Oxide and prevalent cardiovascular disease in a multiethnic population living in Canada. Can J Cardiol, 2015, 31:1189-1194.

[20] Senthong V, Wang Z, Li XS, et al. Intestinal microbiota-generated metabolite trimethylamine-N-Oxide and 5-year mortality risk in stable coronary artery disease: the contributory role of intestinal microbiota in a COURAGE-like patient cohort. J Am Heart Assoc,2016, 5. pii: e002816. doi: 10. 1161/JAHA. 115. 002816.

[21] Senthong V, Li XS, Hudec T, et al. Plasma trimethylamine N-Oxide, a gut microbe-generated phosphatidylcholine metabolite, is associated with atherosclerotic burden. J Am Coll Cardiol, 2016, 67: 2620-2628.

[22] Lever M, George PM, Slow S, et al. Betaine and trimethylamine-N-oxide as predictors of cardiovascular outcomes show different patterns in diabetes mellitus: An observational study. PLoS One, 2014, 9:e114969.

[23] Karlsson FH, Fak F, Nookaew I, et al. Symptomatic atherosclerosis is associated with an altered gut metagenome. Nat Commun, 2012, 3:1245.

[24] Koren O, Spor A, Felin J, et al. Human oral, gut, and plaque microbiota in patients with atherosclerosis. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(Suppl 1): 4592-4598.

[25] Kelly TN, Bazzano LA, Ajami NJ, et al. Gut microbiome associates with lifetime cardiovascular disease risk profile amongbogalusa heart study participants. Circ Res, 2016, 119: 956-964.

[26] Zhu W, Gregory JC, Org E, et al. Gut microbial metabolite TMAO enhances platelet hyperreactivity and thrombosis risk. Cell, 2016, 165:111-124.

[27] Tilg H. A gut feeling about thrombosis. N Engl J Med, 2016, 374:2494-2496.

[28] Kimura I, Ozawa K, Inoue D, et al. The gut microbiota suppresses insulin-mediated fat accumulation via the short-chain fatty acid receptor GPR43. Nat Commun, 2013, 4: 1829.

[29] Sayin SI, Wahlstrom A, Felin J, et al. Gut microbiota regulates bile acid metabolism by reducing the levels of tauro-beta-muricholic acid,a naturally occurring FXR antagonist. Cell Metab, 2013, 17: 225-235.

[30] Zhao L. The gut microbiota and obesity: from correlation to causality.Nat Rev Microbiol, 2013, 11: 639-647.

[31] Neves AL, Coelho J, Couto L, et al. Metabolic endotoxemia: a molecular link between obesity and cardiovascular risk. J Mol Endocrinol, 2013,51: R51-R64.

[32] Manco M, Putignani L, Bottazzo GF. Gut microbiota,lipopolysaccharides, and innate immunity in the pathogenesis of obesity and cardiovascular risk. Endocr Rev, 2010, 31: 817-844.

[33] Seldin MM, Meng Y, Qi H, et al. Trimethylamine N-oxide promotes vascular inflammation through signaling of mitogen-activated protein kinase and nuclear factor-kappaB. J Am Heart Assoc, 2016, 5. pii:e002767. doi: 10. 1161/JAHA. 115. 002767.

[34] David LA, Maurice CF, Carmody RN, et al. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Nature, 2014, 505:559-563.

[35] Grayston JT, Kronmal RA, Jackson LA, et al. Azithromycin for the secondary prevention of coronary events. N Engl J Med, 2005, 352:1637-1645.

[36] Delzenne NM, Neyrinck AM, Backhed F, et al. Targeting gut microbiota in obesity: effects of prebiotics and probiotics. Nat Rev Endocrinol, 2011, 7: 639-646.

[37] Cashman JR, Zhang J. Human flavin-containing monooxygenases.Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2006, 46: 65-100.

[38] Wang Z, Roberts AB, Buffa JA, et al. Non-lethal inhibition of gut microbial trimethylamine production for the treatment of atherosclerosis. Cell, 2015, 163: 1585-1595.

[39] Tang WH, Wang Z, Fan Y, et al. Prognostic value of elevated levels of intestinal microbe-generated metabolite trimethylamine-N-oxide in patients with heart failure: refining the gut hypothesis. J Am Coll Cardiol, 2014, 64: 1908-1914.

[40] Tang WH, Wang Z, Kennedy DJ, et al. Gut microbiota-dependent trimethylamine N-oxide (TMAO) pathway contributes to both development of renal insufficiency and mortality risk in chronic kidney disease. Circ Res, 2015, 116: 448-455.

[41] Dambrova M, Latkovskis G, Kuka J, et al. Diabetes is associated with higher trimethylamine N-oxide plasma levels. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2016, 124: 251-256.

国家自然科学基金项目（81670329）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程经费资助（编号①2016-IZM-3-011②2016-IZM-1-011）

100730 北京市，中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 心内科

刘红宏 博士研究生 主要从事肠道微生物方面的研究 Email: liuhonghong0625@163.com 通讯作者: 张抒扬 Email: shuyangzhang103@ 163. com

R541.4

A

1000-3614（2017）12-1237-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.12.025

2017-03-05)

（编辑：梅平）