甘草酸对大鼠空肠收缩作用的研究

沈德利 郭喜顺

（大连市第三人民医院药剂科，辽宁 大连 116033）

甘草酸对大鼠空肠收缩作用的研究

沈德利 郭喜顺

（大连市第三人民医院药剂科，辽宁 大连 116033）

目的分析甘草酸对胃肠收缩的作用。方法制作大鼠离体空肠标本，记录不同浓度的甘草酸对大鼠离体空肠平滑肌正常收缩的影响。结果甘草酸剂量依赖性地促进了大鼠离体空肠的平滑肌收缩；甘草酸对肠平滑肌的兴奋作用可分别被 M 受体阻断药阿托品及钙通道阻滞剂维拉帕米阻断。讨论甘草酸明显促进大鼠离体空肠平滑肌收缩作用，呈剂量依赖性；在4种不同低收缩状态下，其兴奋作用仍然存在。

甘草酸；空肠；平滑肌收缩

甘草酸是甘草中最重要的活性成分，有抗衰老、抗炎、抗过敏、降压、增强免疫力、抑制癌细胞生长等作用[1-2]。离体实验发现，甘草煎剂能增加大鼠胃底纵行肌和环行肌张力、胃体纵行肌张力和幽门环行肌运动指数，具有促进胃肠动力作用[3-4]。本研究考察了甘草酸对大鼠离体空肠收缩的调节作用并初步揭示其作用机制。见下文。

1 材料与方法

1.1 实验材料：①实验动物SD大鼠，雄性，180～220 g，大连医科大学实验动物中心提供。②主要仪器、设备。HM-3S型pH计：日本东亚电波工业株式会社产品；MA240D型电子分析天平：上海第二天平仪器厂产品；CJ-1磁力搅拌器：上海沪西分析仪器厂产品；漩涡混合器：江苏海门麒麟医用仪器厂产品；PS-9型电泳仪：大连捷迈科技公司；UVP凝聚成像系统：英国UVP有限公司；FTC51F2D PCR仪：英国巴罗世界科技公司；HW-400S恒温平滑肌槽，BL-420F生物机能实验系统：成都泰盟科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 离体小肠平滑肌条的制备：大鼠预先禁食48 h，但给水，脱颈处死大鼠，剖腹，取1.5～2 cm空肠，除去肠系膜，放于克氏液中备用。浴管内克氏液保持恒温37 ℃。L型管置于浴管内。

1.2.2 标本连接：将平滑肌置入装有20 mL的37 ℃克氏液浴槽中，并通以95%O2和5% CO2，稳定约50 min，开始记录收缩曲线。

1.2.3 便秘模型建立：健康雌雄各半的SD大鼠正常饲养3 d后，剔除有异常反应或体质量有明显差异的大鼠后，随机分为正常对照组，便秘模型组，便秘模型给药组，每组6只，单只单笼饲养，事先称重。

1.2.4 Western blotting：在各实验组大鼠取血后，自幽门下10 cm处切取空肠8 cm，4 ℃克氏液洗净，切成2 cm长的肠段，立即置于液氮中，然后-80 ℃保存待测。总蛋白提取：称量空肠组织，配裂解液，裂解液与组织按500 μL：100 mg混合，剪碎组织，匀浆，离心15000 r，15 min，取上清，测蛋白浓度，将所有样品蛋白浓度均稀释至最低浓度，按1∶1加上样缓冲液100 ℃煮沸5 min，-20 ℃保存。电泳：配12%分离胶和5%浓缩胶，上样，电泳至溴酚蓝刚跑出即可，停止电泳，取胶。转膜：按滤纸（3层）-PVDF膜-胶-滤纸（3层）放入电转槽，吸干电转液，通电25 min。封闭。免疫反应：将MLC、P-MLC、MLCK以及β-actin蛋白抗体分别配成1∶1000和1∶800的浓度，4 ℃孵育过夜，然后用TTBS室温下脱色摇床洗3次，每次5 min。同上方法用稀释二抗（1∶2000），室温下孵育90 min，用TTBS室温下，脱色摇床上洗3次，每次5 min。化学发光，显影，定影，凝胶图像分析：将发光底物工作液A和B等体积混合1 min后，将蛋白与此混合液充分避光接触1 min，显影，进行图像扫描分析。1.3 统计处理：用统计分析方法处理平滑肌收缩幅度变化。SPSS18.0对数据进行统计分析，实验数据用均数±标准差（x-±s）表示，t检验，P＜0.05具有显著性意义。

2 结 果

2.1 正常收缩状态下甘草酸对大鼠空肠收缩作用：平滑肌收缩稳定后，在浴槽中依次加入不同浓度的甘草酸，其终浓度分别为20、40、80 μmol/L。观察并记录5 min内的收缩曲线，取均数后作为实验数据。甘草酸对大鼠空肠平滑肌的收缩活动有兴奋作用，且与剂量呈正向关系。

2.2 甘草酸对空肠收缩作用的机制探讨：钙离子是平滑肌收缩的关键因子，M受体是兴奋平滑肌的经典受体，能够促进平滑肌的收缩。因此，在本实验中考察钙离子，M受体与甘草酸所起兴奋作用的关系。

平滑肌收缩稳定后，分别向克氏液中加入1.0 μmol/L钙通道阻滞剂维拉帕米（verapamil）及10.0 μmol/L M受体阻断剂阿托品（atropine），然后依次加入不同浓度的甘草酸，其终浓度分别为20、40、80 μmol/L。观察并记录5 min内的收缩曲线，取均数后作为实验数据。钙通道和M受体被阻断情况下甘草酸对大鼠空肠平滑肌的收缩活动有兴奋作用，且与剂量呈正向关系。

2.3 甘草酸对肌球蛋白磷酸化的影响：模型大鼠小肠组织中肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和肌球蛋白磷酸化水平均显著低于正常对照组，甘草酸可以显著增加MLCK的含量和肌球蛋白磷酸化水平。

3 讨 论

本研究结果表明，在20、40、80 μmol/L浓度条件下，甘草酸对空肠平滑肌收缩均可起到明显的兴奋作用，并且随着浓度增大，兴奋作用更加明显。本结果提示，在20～80 μmol/L剂量范围内，甘草酸对空肠平滑肌收缩起到剂量依赖性的兴奋作用。

为进一步验证甘草酸的作用，本研究又探讨了在低钙、低钾、肾上腺素、硝普钠4种不同条件造成的平滑肌低收缩状态下，甘草酸对空肠平滑肌收缩作用的影响。结果表明，在这4种条件造成的平滑肌低收缩情况下，甘草酸对空肠平滑肌收缩依然可起到明显的兴奋作用。提示，甘草酸对空肠平滑肌的收缩的兴奋作用进一步得到验证[5-6]。

本研究还研究了甘草酸对空肠平滑肌收缩所起到作用可能的机制。平滑肌收缩是在钙离子参与下，肌球蛋白轻链激酶催化肌球蛋白轻链磷酸化实现的。胃肠道中存在的M受体能兴奋平滑肌的收缩。本研究中分别应用钙通道阻断剂维拉帕米和M受体阻断剂阿托品来探讨机制。结果表明，在克氏液中加入维拉帕米后，平滑肌收缩急剧下降，待收缩平衡后，再分别加入20、40、80 μmol/L的甘草酸，结果3个剂量的甘草酸对平滑肌收缩均不能起到兴奋作用。这表明维拉帕米阻断了甘草酸对平滑肌收缩的兴奋作用，甘草酸对空肠平滑肌收缩的兴奋作用是钙依赖性的。在克氏液中加入M受体阻断剂阿托品后，平滑肌收缩基本没发生变化，待平滑肌收缩稳定后，再分别向克氏液中加入20、40、80 μmol/L的甘草酸，结果这3个剂量的甘草酸对平滑肌收缩的兴奋作用检测不到了。表明阿托品阻断了甘草酸对空肠平滑肌收缩的作用，即甘草酸对平滑肌收缩的兴奋作用依赖于M受体的激活。

为进一步研究甘草酸对空肠平滑肌收缩所起到的作用，我们考察了甘草酸对小肠组织中肌球蛋白轻链激酶（MLCK）含量及肌球蛋白磷酸化的影响。结果表明，便秘模型组小肠组织中MLCK含量及肌球蛋白磷酸化水平显著低于正常对照组，加入甘草酸可以显著恢复MLCK含量和肌球蛋白磷酸化水平。结果揭示了甘草酸是通过增强肌球蛋白磷酸化水平实现对平滑肌收缩的兴奋作用。

简而言之，本研究的结果提示，在20～80 μmol/L剂量范围内，甘草酸对空肠平滑肌收缩所起到显著的兴奋作用，这种兴奋作用是钙依赖性的，并依赖于M受体的激活，增强肌球蛋白磷酸化水平实现的。

[1] 周荣汉.中药资源学[M].北京:中国医药科技出版社,1993:299.

[2] 郑虎占,董泽宏,余靖,等.中药现代研究与应用[M].北京:学苑出版社,1997:1256-1279.

[3] 刘丽萍,任翠爱,赵宏艳.甘草酸的免疫调节作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(6):272-276.

[4] 齐敏.甘草酸药理作用及机制的研究进展[J].牡丹江医学院学报,2009,30(3):79-81.

[5] 徐立昌,郑淑玲,张伟东,李魁兴.甘草酸的药理机制研究进展[J].中外医疗,2009,28(26):174-175

[6] 邹龙,王连平.正交试验法优选护肝醒酒浓缩丸的醇提工艺[J].中南药学,2013,11(1):14-18.

R282.710.7 文献标识码：B 文章编号：1671-8194（2017）30-0023-02