牛副流感病毒3型检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，莫 玲，刘吉山

（滨州市畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

牛副流感病毒3型检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，莫 玲，刘吉山

（滨州市畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

牛呼吸道疾病综合征是引起世界范围内饲养牛发病和死亡的主要原因，严重危害着养牛业的发展。本文介绍了牛副流感病毒3型的病原学检测方法，包括病毒分离与鉴定、分子生物学检测方法和血凝试验，以及血清学检测方法，包括血凝抑制试验、免疫荧光试验、中和试验、酶联免疫吸附实验和液相芯片技术等。通过综述近年来牛副流感病毒3型的最新实验室检测方法研究进展，为该病检测和诊断提供参考。

牛副流感病毒3型；牛呼吸道疾病综合征；检测；研究进展

牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）是引起世界范围内饲养牛发病和死亡的主要原因，严重危害着世界养牛业的发展。牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）、牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）以及牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）是BRDC的主要病原。BPIV3通常被称为“运输热”病毒，属于副黏病毒科呼吸道病毒属。BPIV3感染主要引起成年牛和犊牛的肺炎、支气管肺炎和被感染肺叶的实变。临床上主要表现为发热、流泪、流鼻涕和呼吸加快等症状。BPIV3最早分离于美国，目前在牛群中的感染已呈世界性分布。BPIV3有3个基因型，分别为A型、B型和C型，我国的分离株主要为A型和C型。BPIV3本身致病力不强，但在其他继发性细菌（多杀性巴氏杆菌或溶血性巴氏杆菌）及外界诱因（长途运输、饥饿、受寒等）的联合作用下，则可引发严重的呼吸道症状，甚至可引起病牛的死亡。目前我国对BPIV3的研究处于起步阶段，尚没有特效药物和疫苗。控制BPIV3的传播对预防BRDC具有重要意义。本文综述了近年来BPIV3的最新实验室检测方法研究进展，以期为预防和控制该病提供参考。

1 病原学检测方法

1.1 病毒分离与鉴定

病原学检测最常用的方法为病毒的分离与鉴定。采集病牛的鼻拭子擦拭液或病变组织，经处理后接种牛肾传代细胞（MDBK）培养。BPIV3在细胞上通常会产生典型的细胞病变（CPE），如细胞融合和蚀斑等。有一些毒株不会产生明显的CPE，可以使用红细胞吸附试验来确认是否有病毒存在，常用的有牛红细胞和豚鼠红细胞，但有些毒株要在体外适应一段时间后才能出现红细胞吸附现象。电镜观察，BPIV3有囊膜，小在150～250 nm之间。刘鹏[1]利用MDBK细胞从黑龙江省某牛场病牛鼻液中分离到1株可产生特定的CPE，经过理化特性和核酸序列测定分析后确定为A型BPIV3。吕闯等[2]在山东省首次分离到基因C型的BPIV3。

1.2 分子生物学检测方法

1.2.1 RT-PCR。Vaucher等[3]根据BPIV3的HN基因的保守区域设计引物，建立了RT-PCR方法，在所有的检测样品中都能够检测到大小为1 009 bp的目的条带。刘鹏[1]根据BPIV3 HN基因序列设计引物，建立了RT-PCR方法。刘晓乐等[4]针对BPIV3 NP蛋白和BVDV E2基因分别设计了2对引物，建立了快速鉴别BPIV3和BVDV的双重RT-PCR方法，BPIV3的敏感度可达10-3TCID50/0.1 mL。Thonur等[5]针对IBRV的糖蛋白B基因、BRSV核衣壳基因、BPIV3的核蛋白基因设计的多重反转录定量PCR（mRT-qPCR），通过对临床541份样品检测与传统的病毒分离和间接免疫荧光抗体试验技术比较，证明了该方法更快速，特异性高，并且比病毒分离和间接免疫荧光抗体技术更加敏感。索阳等[6]选择BVDV的5´UTR序列附近保守核苷酸序列、BRSV的F基因的保守区及BPIV3高度保守性NP蛋白基因设计引物，建立了可用于检测上述3种病毒的三重RT-PCR方法。该法能检出10 pg的BVDV、1 pg的BPIV3和10 pg的BRSV。倪宏斌等[7]从新疆石河子、奎屯、库尔勒、沙湾、阿克苏地区的5个规模化奶牛场采集1月龄以内犊牛鼻液206份，其中发病犊牛180份，相同日龄健康犊牛46份，通过采用双抗体夹心ELISA的方法检测BPIV3抗原，RT-PCR方法检测BPIV3 M基因，并挑选不同地区的8株病毒进行序列分析比较其同源性，进行基因分型。结果ELISA方法检测的感染率仅为2.43%，PCR方法检测的感染率为35.44%；扩增的M基因序列同源性为97.90%，与参考的BPIV3 A亚型毒株的同源性为96.40%～99.60%，将其划分为BPIV3 A亚型。

1.2.2 荧光定量RT-PCR。董秀梅等[8]基于BPIV3 M基因设计引物及探针，建立了Taq Man实时荧光定量RT-PCR检测方法，用于快速定量检测BPIV3。

1.2.3 RT-LAMP。师新川等[9]依据BPIV3 NP基因设计了4条引物，建立了RT-LAMP方法，整个反应过程只需1 h，检测最低限达0.069 fg/µL，为普通RT-PCR灵敏度的1 000倍。在反应体系中添加荧光染料后，可通过肉眼直接判断有无扩增产物，而不需要凝胶电泳，在基层的快速检测中具有较好的应用前景。

1.3 血凝试验（HA）

副黏病毒为主要的红细胞凝集性病毒。BPIV3可以凝集鸡、豚鼠和人的“O”型红细胞，根据这一特性可以鉴定BPIV3。HA试验具有成本低、操作方便，能在短时间内获得结果等优点，是该病毒常用的检测方法，但BPIV3在保存和运输过程中存在很大的变异性，试验往往会导致假阴性，出现误判。

2 血清学检测方法

2.1 血凝抑制试验（HI）

由于牛血清具有非特异性的血凝抑制活性，在进行HI试验前应进行预处理，以消除非特异性反应。BPIV3感染程度较轻的牛不出现临床症状，但HI效价一般可达1:40；感染后出现临床症状的牛血清的HI效价则可达1:640甚至更高。在检测时最好有急性期和康复期的双份血清的结果，这样才有说服力。

2.2 免疫荧光试验

王海勇[10]初步建立了检测BPIV3的直接免疫荧光方法。该法具有良好的敏感性和特异性，检测到BPIV3的最小剂量为10 TCID50/mL，为BPIV3抗原的检测提供了重要的手段。

2.3 中和试验

中和试验是经典的鉴定BPIV3的血清学检测方法。霍志云等[11]从内蒙古、吉林、山西3个省采集牛血清样品482份，采用病毒中和试验方法进行BPIV3抗体检测；结果482份血清中BPIV3阳性共439份，阳性率为91.08%，表明这3个省份的牛群中普遍存在BPIV3感染。王海勇等[12]从黑龙江、辽宁、新疆、云南、贵州、广西、河北、山东、河南、江西、湖南和福建等12个省份采集牛血清样品2 489份，进行中和试验，结果显示，除江西省阳性率为27.8%之外，其他省份阳性率均高于50%；2 489份血清样品中阳性样品数为1 932份，总体阳性率为77.6%。表明BPIV3在我国流行比较广泛。中试试验准确性高，但操作复杂、试验周期长，限制了其在临床上快速诊断方面的应用。

2.4 ELISA

吴海涛[13]和史鸿飞[14]分别用原核表达的BPIV3 HN蛋白和N蛋白作为包被抗原初步建立了检测BPIV3抗体的间接ELISA方法。刘鹏[1]利用纯化后的重组N蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA方法并对黑龙江省部分地区的603份牛血清样本进行检测，结果发现BPIV3的抗体阳性率为78.44%。周玉龙等[15]以原核表达的BPIV3 HJ-1株重组HN蛋白为包被抗原建立间接ELISA方法，与中和试验符合率高达96%。吕闯[16]用碳酸盐缓冲液（CBS）将BPIV3粗分离病毒液作200倍稀释包被ELISA板，以制备的BPIV3核衣壳蛋白的5E5单抗为待阻断抗体建立了固相阻断ELISA（SPB-ELISA）。应用该法对231份免疫牛血清及54份来自哈尔滨市周边地区牛血清进行抗体检测，结果发现免疫牛血清中的阳性样品数为220份，阳性率为95.2%；哈尔滨市周边地区牛血清中阳性血清样品数为34份，阳性率为62.9%。任建乐[17]成功制备了7株针对NP蛋白的单克隆抗体并应用2个不同抗原表位的单抗6F8和7G9建立了双抗体夹心ELISA（DAS-ELISA）方法。李丽阳等[18]以纯化的兔抗BPIV3多克隆抗体（PAb）作为包被抗体，鼠抗BPIV3单克隆抗体（MAb）作为检测抗体，建立了BPIV3双抗体夹心ELISA方法。利用该方法和RT-PCR对75份牛鼻拭子临床样品进行检测，结果发现两者符合率为94.6%。杨建乐等[19]通过分析NP和HN蛋白主要抗原表位区并对其串联后原核表达，以纯化的重组蛋白为包被抗原建立了间接ELISA方法，对采自山东、辽宁和天津等地的270份临床血清样本检测结果发现总的阳性率为82.59%（223/270）。因此，ELISA方法适用于兽医基层临床样品的大规模检测。

2.5 液相芯片技术

Anderson等[20]用美国Luminex公司研制的液相芯片技术设计了多重检测牛血清抗体技术，可以在1个血清样本中同时检测病原（BVDV、IBRV、BPIV3、BRSV）相应的抗体，并与ELISA相比较，其敏感度、特异性基本一致，实现了一个液相反应体系下检测多种病原抗体，该技术最高可同时检测100种病原，在传染病诊断技术方面有很好的应用前景。

3 小结

目前我国牛群中已经普遍存在BPIV3的感染，严重危害着养牛业的健康发展。由于本病尚无特效治疗药物和方法，且随着我国养牛业的集约化发展，不少牛舍养殖密度大、空气质量差，这些因素的存在为该病的传播和流行提供了条件。本文所述的检测方法各有优缺点，在实际应用中可以根据具体情况及对检测结果的要求，选择合适的检测方法，也可以将多种方法结合使用。随着检测方法的不断改进以及新技术的不断创新，BPIV3的检测方法也将日趋发展完善，相信研制更加灵敏、特异、方便、适用于基层的检测技术指日可待，这对预防牛呼吸道疾病意义重大。

参考文献：

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[3] VAUCHER R D，SIMONETTI A B，ROEHE P M. RT-PCR for detection of bovine parainfluenza virus type 3（BPIV-3）[J]. Acta scientiae veterinariae，2008，36（3）：215-220.

[4] 刘晓乐，张敏敏，陈颖钰，等. 牛副流感病毒3型RTPCR检测方法的建立[J]. 中国奶牛，2011，22：1-4.

[5] THONUR L，MALEY M，GILRAY J，et al. Onestep multiplex real time RT-PCR for the detection of bovine respiratory syncytial virus，bovine herpesvirus 1 and bovine parainfluenza virus 3[J]. BMC veterinary research，2012（8）：37-45.

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[7] 倪宏斌，剡根强，张坤，等. 新疆部分地区牛副流感病毒3型的检测与基因分型[J]. 畜牧与兽医，2016，48（12）：72-75.

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[9] 师新川，温永俊，王凤雪，等. 牛副流感病毒3型RTLAMP检测方法的建立及应用[J]. 中国畜牧兽医，2012，39（11）：31-34.

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[11] 霍志云，童钦，胡嘉欣，等. 北方三省（区）牛副流感病毒3型的血清学调查[J]. 动物医学进展，2012，33（9）：124-126.

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[13] 吴海涛. 牛副流感病毒3型的分离鉴定和间接ELISA方法建立及初步应用[D]. 大庆：黑龙江八一农垦大学，2010.

[14] 史鸿飞. 牛副流感病毒3型山东分离株核衣壳蛋白表达鉴定、多抗制备及应用[D]. 北京，中国农业科学院，2010. [15] 周玉龙，任亚超，朱战波，等. 牛副流感病毒3型HN基因原核表达及间接ELISA方法建立[J]. 病毒学报，2012，28（1）：23-28.

[16] 吕闯. 牛副流感病毒3型NP单抗制备及固相阻断ELISA的建立和应用[D]. 北京：中国农业科学院，2012.

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[18] 李丽阳，李艳婷，余丽芸，等. 牛副流感病毒3型双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2016，38（2）：132-136.

[19] 杨建乐，赵贵民，侯佩莉，等. 牛副流感病毒3型抗体间接ELISA检测方法的建立与初步应用[J]. 动物医学进展，2016，37（11）：19-24.

[20] ANDERSON S，WAKELEY P，WIBBERLEY G，et al. Development and evaluation of a Luminex multiplex serology assay to detect antibodies to bovine herpes virus 1，parainfluenza 3 virus，bovine viral diarrhoea virus，and bovine respiratory syncytial virus，with comparison to existing ELISAdetection methods[J]. Journal of immunological methods，2011，366（1/2）：79-88.

（责任编辑：杜宪）

Research Progress on the Detection Methods of Bovine Parainfuenza Virus Type 3

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，Mo Ling，Liu Jishan
（Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600）

Bovine respiratory disease complex is the main cause of the morbidity and mortality of feeding cattle in the world，endangering the development of cattle industry in the world. Bovine parainfluenza virus type 3 is one of the major facts of bovine respiratory disease complex. The methods for the detection of Bovine parainfluenza virus type 3 were introduced，including isolation and identification of viruses，molecular biological methods and hemagglutination tests. Serological detection methods，including hemagglutination inhibition test，immunofluorescence test，neutralization test，ELISA and liquid chip technique，were introduced. the latest laboratory detection methods of bovine parainfluenza virus type 3 in recent years were reviewed in this article，so as to provide reference for detection and diagnosis of the disease.

Bovine parainfluenza virus type 3；Bovine respiratory disease complex；detection；research progress

S851.34

B

1005-944X（2017）09-0067-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.09.019

山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系牛产业创新团队项目（SDAIT-09-12）