康复新液化学成分研究△

吕娜，沈连刚，李广志，王钧篪，斯建勇

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

·基础研究·

康复新液化学成分研究△

吕娜，沈连刚，李广志，王钧篪，斯建勇

(中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

目的：研究康复新液的化学成分。方法：采用硅胶、Sephadex LH-20柱色谱及半制备液相色谱分离，MS、NMR等波谱学技术鉴定化合物结构。结果：共得到并鉴定了13个化合物，分别为尿嘧啶(1)、次黄嘌呤(2)、cyclo-(Tyr-Gly)(3)、原儿茶酸(4)、肌苷(5)、丙三醇(6)、亮氨酸(7)、异亮氨酸(8)、苯丙氨酸(9)、酪氨酸(10)、缬氨酸(11)、丙氨酸(12)、甘氨酸(13)。结论：化合物3、4为首次从美洲大蠊提取物中分离得到。

美洲大蠊；康复新液；核苷；氨基酸；环肽

美洲大蠊，俗称蟑螂，偷油婆等，是有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，见于除两极之外的世界各地。虽为世界性卫生害虫，但在我国西南民间有将其外敷治疗伤口的习俗，据此大理学院的李树楠教授开发研制出对各种外伤、溃疡、瘘管、褥疮的创面有良好效果的美洲大蠊单方制剂——“康复新液”，临床应用广泛，不良反应小。但因其药效成分尚不明确，对于康复新液的质量标准的优化、制剂本身的推广应用和市场国际化都形成了较多的阻碍。为此本实验对康复新液的化学成分进行分离和鉴定，得到了13个化合物，分别是尿嘧啶(1)、次黄嘌呤(2)、cyclo-(Tyr-Gly)(3)、原儿茶酸(4)、肌苷(5)、丙三醇(6)、亮氨酸(7)、异亮氨酸(8)、苯丙氨酸(9)、酪氨酸(10)、缬氨酸(11)、丙氨酸(12)、甘氨酸(13)；其中化合物3、4为首次从康复新液中分离得到。

1 仪器与试剂

2435型分析液相色谱仪系统(美国WATERS公司)；梅特勒电子天平MS105DU(瑞士METTLER TOLEDO公司)；2535型半制备液相色谱仪系统(美国WATERS公司)；AVANCE Ⅲ 600MHz核磁共振仪(德国BRUKER公司)；LTQ-Obitrap XL液质联用仪(Thermofisher)；四孔电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)；JR-360D超声清洗器(北京精锐泽祥实验仪器有限公司)；薄层色谱硅胶板HSGF254(烟台市化学工业研究所)。

康复新液(四川好医生药业集团)；次黄嘌呤对照品(批号：140661-200903)、肌苷对照品(批号：140669-201305)、尿嘧啶对照品(批号：100469-201302)，购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为哇哈哈纯净水，其余试剂均为化学纯。

2 方法与结果

2.1 样品的分离

将康复新液浓缩液329.4 g用适量水混悬后，用三氯甲烷萃取，合并萃取液减压浓缩得三氯甲烷溶性部位和水部位浸膏。将三氯甲烷溶性部位浸膏经甲醇溶解后与等量的硅胶(300～400目)拌匀装柱，依次用三氯甲烷-甲醇(100∶0～0∶100，V/V)梯度洗脱，经TLC分析后合并得到10个主流分(Fr.A-Fr.J)。Fr.A，Fr.C，Fr.F，Fr.G，Fr.I，Fr.J各有不溶物析出，过滤后，将沉淀反复重结晶，经Sephadex LH20(甲醇-水)、制备型薄层硅胶板分离纯化，从Fr.A中得到白色晶体1(14.7 mg)，从Fr.C中得到浅黄色晶体2(106.8mg)，从Fr.F中得到白色粉末7和8(7.3 mg)，从Fr.G制得白色粉末10(58.7 mg)和11(213.7 mg)，从Fr.I中得到白色粉末12(250.9 mg)，从Fr.J获得黄色粉末13(1.6 mg)。

其次，Fr.C、Fr.D、Fr.E经过反复硅胶柱色谱(石油醚-乙酸乙酯)、制备型HPLC(甲醇-水)等色谱技术分离纯化，又从Fr.C中得到白色针晶3(4.6 mg)，从Fr.D中得到褐色粉末4(14.3 mg)，白色晶体5(37.7 mg)，从Fr.E中得到浅黄色油状物6(113.0 mg)，白色粉末9(24.6 mg)。

2.2 化合物结构鉴定

化合物1：白色晶体，用HPLC分析液相测得tR=6.698，与尿嘧啶对照品保留时间一致(tR=6.111)；与对照品混合点样，经TLC分析后，确定该化合物为尿嘧啶。

化合物2：浅黄色晶体，用HPLC分析液相测得tR=9.635，与次黄嘌呤对照品保留时间一致(tR=9.883)，与次黄嘌呤对照品混合点样，经TLC分析，确定该化合物为次黄嘌呤。

化合物3：白色针晶，环肽反应呈阳性，1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δH：9.29(1H，s，OH)，8.08(1H，s，NH)，7.84(1H，s，NH)，6.93(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-7′)，6.65(2H，d，J=8.4 Hz，H-4′，H-6′)，3.96(1H，d，J=3.0 Hz，Ha-4)，3.29(1H，s，J=3.0 Hz，Hb-4)，2.97(1H，dd，J=4.2 Hz，13.8 Hz，H-1′)，2.74(1H，dd，J=4.2 Hz，13.8 Hz，H-1′)；13C-NMR(DMSO-d6，150 MHz)δC：167.3(C-1)，165.7(C-3)，156.3(C-5′)，131.0(C-3′，C-7′)，125.7(C-2′)，114.9(C-4′，C-6′)，55.7(C-2)，43.6(C-4)，38.2(C-1′)，以上波谱数据与文献报道数据基本一致[1]，故鉴定该化合物为cyclo-(Tyr-Gly)，为首次分离得到。

化合物4：褐色粉末，1H-NMR(CD3OD，600 MHz)δH：7.40(1H，s，H-6)，7.39(1H，s，H-2)，6.78(1H，d，J=6.0 Hz，H-5)；13C-NMR(CD3OD，150 MHz)δC：170.3(C-7)，151.5(C-4)，146.1(C-3)，123.9(C-6)，123.3(C-1)，117.7(C-2)，115.8(C-5)。以上波谱数据与文献报道数据基本一致[2]，故鉴定该化合物为原儿茶酸，为首次分离得到。

化合物5：白色晶体，用HPLC分析液相测得tR=19.503，与肌苷对照品保留时间一致(tR=19.884)，与肌苷对照品混合点样，经TLC分析，确定该化合物为肌苷。

化合物6：浅黄色油状物，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.68(1H，m，H-2)，3.55(2H，dd，J=6.0，12.0 Hz，Ha-1，Hb-1)，3.47(2H，dd，J=6.0，12.0 Hz，Ha-3，Hb-3)，13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：72.1(C-2)，62.7(C-1，C-3)，以上波谱数据与文献报道数据基本一致[3]，故鉴定该化合物为丙三醇。

化合物7：白色粉末，茚三酮反应呈阳性，ESI-MS：m/z132.101 6 [M+H]+；1H-NMR(600 MHz，D2O)δH：3.71(1H，t，H-2)，1.71(1H，m，H-4)，1.66(2H，m，H-3)，1.00(3H，t，H-5)，1.00(3H，t，H-6)；13C-NMR(150 MHz，D2O)δC：175.5(C-1)，53.4(C-2)，39.8(C-3)，24.1(C-4)，22.0(C-5)，20.8(C-6)。以上波谱数据与文献报道数据基本一致[4]，故鉴定该化合物为L-亮氨酸。

化合物8：白色粉末，茚三酮反应呈阳性，ESI-MS：m/z132.101 6 [M+H]+；1H-NMR(600 MHz，D2O)δH：3.60(1H，d，J=4.2 Hz，H-2)，2.26(1H，m，H-3)，1.71(2H，m，H-4)，1.25(3H，m，H-5)，1.46(3H，m，H-6)；13C-NMR(150 MHz，D2O)δC：174.1(C-1)，59.5(C-2)，35.8(C-3)，24.1(C-4)，11.1(C-5)，14.5(C-6)。以上波谱数据与文献报道数据基本一致[4]，故鉴定该化合物为异亮氨酸。

化合物9：白色粉末，茚三酮反应呈阳性，ESI-MS：m/z166.053 1 [M+H]+；1H-NMR(600 MHz，D2O)δH：7.50(2H，t，H-6，H-8)，7.45(1H，t，H-7)，7.40(2H，d，J=12.0 Hz，H-5，H-9)，4.06(1H，m，H-2)，3.36(1H，dd，J=6.0，18.0 Hz，Ha-3)，3.19(1H，dd，J=6.0，12.0 Hz，Hb-3)；13C-NMR(150 MHz，D2O)δC：174.0(C-1)，135.3(C-4)，129.5(C-6，C-8)，129.2(C-5，C-9)，127.8(C-7)，56.2(C-2)，36.5(C-3)。以上波谱数据与文献报道数据基本一致[5]，故鉴定该化合物为苯丙氨酸。

化合物10：白色粉末，茚三酮反应呈阳性，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：7.17(2H，d，J=8.4 Hz，H-2′，H-6′)，6.88(2H，d，J=8.4 Hz，H-3′，H-5′)，3.92(1H，q，H-2)，3.18(1H，dd，J=15 Hz，5.4 Hz，Ha-3)，3.03(1H，dd，J=15 Hz，7.8 Hz，Hb-3)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：174.2(C-1)，154.8(C-4′)，130.7(C-2′，C-6′)，126.8(C-1′)，115.8(C-3′，C-7′)，56.0(C-2)，35.8(C-3)。以上波谱数据与文献报道数据基本一致[4]，故鉴定该化合物为酪氨酸。

化合物11：白色粉末，茚三酮反应呈阳性，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.59(1H，d，J=4.2 Hz，H-2)，2.26(1H，m，H-3)，1.02(3H，d，J=7.2 Hz，H-4)，0.97(3H，d，J=7.2 Hz，H-5)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：175.5(C-1)，60.3(C-2)，29.0(C-3)，17.9(C-4)，16.6(C-5)。以上波谱数据与文献报道数据基本一致[4]，故鉴定该化合物为缬氨酸。

化合物12：白色粉末，茚三酮反应呈阳性，ESI-MS：m/z90.054 7 [M+H]+；1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.69(1H，dd，J=7.2，14.4 Hz，H-2)，1.39(3H，d，J=7.2 Hz，H-3)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：175.8(C-1)，50.7(C-2)，16.2(C-3)。以上波谱数据与文献报道数据基本一致[4]，故鉴定该化合物为丙氨酸。

化合物13：黄色粉末，茚三酮反应呈阳性，1H-NMR(D2O，600 MHz)δH：3.45(2H，s，H-2)；13C-NMR(D2O，150 MHz)δC：172.2(C-1)，41.4(C-2)。以上波谱数据与文献报道数据基本一致[4]，故鉴定该化合物为甘氨酸。

3 结果与讨论

从结果来看，美洲大蠊体内富含核苷、氨基酸类物质，这与昆虫药本身的成分特点一致；其次本实验分得一个肽类物质，之前也有学者从美洲大蠊提取物中得到几种环肽类成分[6]，证实这类成分也是美洲大蠊的主要成分之一。有报道称，在用美洲大蠊提取物的不同组分对造模动物的创面进行处理后，疗效最好的组分经分析富集为小分子肽[7]；创面愈合是多种药理活性作用的结果，如抗菌、抗炎、促进组织生长、提高免疫力等。目前已有大量研究表明药用植物和海洋天然产物中得到的不少小分子肽具有很强的生物活性[8-9]，环脂肽类成分已经开发得到多种抗菌素[10]，由此可以推断美洲大蠊体内的活性成分很可能也是肽类成分。因此笔者认为，从美洲大蠊体内获得更多的肽类成分并进行活性筛选以及机制探究,将是未来此类药材研究的趋势和热点之一，相信美洲大蠊作为最古老的中药之一将得到更有效的开发利用。

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StudiesonChemicalComponentsofKangfuxinLiquid

LYUNa，ShenLiangang，LiGuangzhi，WangJunchi，SiJianyong*

(ChineseAcademyofMedicinalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，Beijing100193,China)

Objective：To study the chemical constituents of Kangfuxin Liquid.Methods：The chemical constituents were isolated and purified on silica gel column chromatography，Sephadex LH20 and semi-preparing liquid chromatography，and identified by MS and NMR.Results：Thirteen compounds were obtained and identified as following：uracil(1)，hypoxanthine(2)，cyclo-(Tyr-Gly)(3)，protocatechuic acid(4)，inosine(5)，glycerol(6)，leucine(7)，isoleucine(8)，phenylalanine(9)，tyrosine(10)，valine(11)，alanine(12)，glycine(13).Conclusion：Compounds3and4are isolated fromPeriplanetaamericanafor the first time.

Periplanetaamericana；Kangfuxin Liquid；nucleosides；amino acids；cyclic peptide

国家“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09301-002-001，2011ZX09307-002-01)

] 斯建勇，博士生导师，研究员，研究方向：天然产物化学；Tel：(010)57833299，E-mail：jysi@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.4.003

2016-10-10)

*[