蒙药大花葵对白色念珠菌的试验研究

任志欣 李东霞 杨丽敏

(1.内蒙古自治区中医医院, 内蒙古 呼和浩特 010020; 2.内蒙古医科大学第一附属医院, 内蒙古 呼和浩特 010020; 3.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010059)

蒙药大花葵对白色念珠菌的试验研究

任志欣1李东霞2杨丽敏3

(1.内蒙古自治区中医医院, 内蒙古 呼和浩特 010020; 2.内蒙古医科大学第一附属医院, 内蒙古 呼和浩特 010020; 3.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010059)

目的：观察大花葵的水提物及醇提物对白色念珠菌的体外抑菌试验研究，并观察经大花葵水提物作用后白色念珠菌的超微结构改变。方法：分别制备大花葵的水、醇提物，采用SDA培养基，应用液态稀释法进行体外药敏试验的研究，并对经药物作用前后的白色念珠菌进行扫描电镜观察。结果：大花葵水、醇提物对白色念珠菌的MIC值分别为50mg/mL和100mg/mL，扫描电镜下观察显示，经大花葵水提物作用后的白色念珠菌有较明显的结构改变。结论：通过本试验明确了蒙药对白色念珠菌有较突出的抑制作用，在为临床用药提供理论基础的同时，也为此类疾病的治疗提供新的可供选择的方法，有待于我们进一步深入研究。

蒙药；白色念珠菌；试验研究

白色念珠菌是最常见的条件致病菌，在检出的致病性真菌中占首位[1-2]。目前抗此类真菌的药物种类繁多，但副作用大，且容易复发。因此，具有抗真菌作用的中药及民族药作为纯天然、无污染药物，具有价格低廉，毒副作用小，不易产生耐药性等特点越来越受到人们的关注。本试验在前人研究的基础上[3]，筛选蒙药大花葵( Malva sylvestris?)，即占巴其其格的水提物和醇提物对白色念珠菌进行体外抑菌实验研究，以找出其有效的活性成分，为抗真菌蒙药的研发提供一些新的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料：菌种，白色念珠菌(Candida. Albicams.编号ATCC-11006)由北大医院真菌实验中心提供的标准菌株。实验用蒙药大花葵来自内蒙古中医药研究所。

1.2 方法

1.2.1 培养基：沙堡弱培养基(Sabouraud dextroseagar SDA)，成分为麦芽糖 4g、蛋白胨1g、琼脂2g、蒸馏水100mL。将上述成分按照一定比例混合后，加热充分溶解，121℃,15min高压灭菌。

1.2.2 药物提取：将大花葵粉碎成粗粉。水提取法，取100g药物置于不锈钢锅中，加10倍蒸馏水1000mL侵泡4h后与加石棉网的电炉上加热煎煮1h，绢布过滤，滤出煎液，药渣再加5倍蒸馏水500mL,同时浸泡、煎煮、过滤，将2次滤液混合，加热浓缩至小体积，超滤膜过滤，采用真空干燥箱70减压干燥36h得药材水提物。乙醇提取法：取大花葵粗粉100g置于圆底烧瓶中，加入10倍量95%医用乙醇1000mL，浸泡4h后回流提取1h，绢布过滤，滤出乙醇液，药渣再加5倍量95%医用乙醇500mL，提取同上法相同。将2次乙醇液混合，加热浓缩至小体积，超滤膜过滤，减压回收乙醇至小体积，在水浴锅上继续浓缩成流浸膏，采用真空干燥箱70减压干燥36h得药材醇提取物。

最后将提取物烘干箱内烘干后制成细粉剂。

1.3 抑菌试验

1.3.1 受试菌活化：白色念珠菌接种于平皿内的SDA培养基，于36℃温箱培养48h，培养二代后的新鲜菌落备用。

1.3.2 液态培养基稀释法(倍比稀释法)：将大花葵的水提物和醇提物各称0.5g,分别溶于2.5mL液态沙堡弱培养基(不加蛋白胨)，按倍比稀释法将其在无菌操作台稀释为100g/L，50g/L， 25g/L，12.5g/L和6.25g/L5个浓度。

用生理盐水洗下平皿内培养的新鲜菌落入试管(在无菌操作台操作)，并将洗下的菌落取0.1mL加入4.9mL生理盐水中，再用比浊管比浊，标准管为0.045×108/mL(即原液中菌落数为4500000个/mL)，将其用生理盐水稀释后为10000个/mL。用吸量管吸取已制备好的菌液0.1mL分别加入不同浓度药液中(即每毫升药液中含菌落1000个)，后放入36～37温箱中培养48h后，将药液在酒精灯下从试管中分别倒入已备好的固体SDA培养基的平皿内，再放入36～37温箱中培养同样时间后观察。以上试验选取空白对照组(未加药物接种菌悬液的培养基)为阳性对照，不含药物和菌悬液的纯培养基为阴性对照。

1.3.3 结果判定：该药水、醇提物抑菌试验均重复3次，取重复值或中间值，无菌落生长的平皿内药物浓度即为该药对此菌的最小抑菌浓度(即MIC值)。

1.4 扫描电子显微镜下观察：浓度为50g/L的大花葵水提物放入已活化的白色念珠菌液态培养基中，培养48h后，用无菌蒸馏水离心2次，倒掉上清液，加2.5%的戊二醛固定，后放入4冰箱内24h。然后PBS液冲洗、离心3次，50%、70%、95%、100%梯度酒精脱水。将放在100%酒精中的标本同酒精同放在4℃冰箱中冻结成固体。再用抽滤瓶于真空条件下干燥、喷金，在S-530型扫描电子显微镜下观察药物作用前后白色念珠菌的形态改变。(以上电镜部分在内蒙古农业大学电镜中心完成)

2 结果

2.1 MIC抑菌浓度测定：浓度为100mg/mL的醇提物及浓度为50mg/mL的水提物与空白对照组相比对白色念珠菌有抑制作用，即MIC值分别为100mg/mL和50mg/mL。

2.2 扫描电镜观察结果：未经药物作用的白色念珠菌呈卵圆形，有出芽，菌体表面光滑、无皱褶；经药物作用后的菌体表面结构有明显变化，分生孢子的细胞壁粗糙、出现凹陷、甚至外层剥落，可见菌体球状膨大、皱缩、不规则，且破坏后的菌落成堆出现，有的菌体有缺口、压迹尾巴，菌丝变短变粗，甚至塌陷、剥脱。

3 讨论

近年来，随着免疫抑制剂，广谱抗生素和抗肿瘤药物等的广泛应用，临床常见的真菌性皮肤病有不断上升的趋势，且此类疾病的高发病率，高复发率已伴随经济的发展和社会的进步而日益受到医患双方的重视。蒙医药是祖国医药学的一块瑰宝，是蒙古民族的珍贵遗产。蒙药的化学成分比较复杂，本试验选用醇提和水提两种方式，了解同一药用2种不同方法提取后抗白色念珠菌方面的差异

本试验选用大花葵水、醇提物对白色念珠菌进行体外抑菌试验，结果表明：大花葵水提物MIC值为50mg/mL，醇提物为100mg/mL。扫描电子显微镜下大花葵水提物对白色念珠菌有破坏作用，使菌丝弯曲，肿胀。由此进一步证实大花葵水提物对白色念珠菌有抑制作用。通过本试验，可以为临床用药提供理论基础的同时也为此类疾病的治疗提供新的可供选择的方法。

[1].李莉，苏天璐，苗翠，等.白色念珠菌对临床常用抗真菌药物的耐药性分析[J].中国实验诊断学，2011,15(1):126～128.

[2]江园萍，章强强，李莉.328株真菌病原菌分析[J].皮肤病与性病，2012,34(4)：214～215.

[3]包德毕历格，陈德珍，秦效勇，等.60种蒙药试管内抑制真菌作用的初步实验研究[J].中国皮肤性病学杂志，1991,5(2)：80～82

2016年8月10日收稿

R291.2

A

1006-6810(2017)02-0068-02