从猪主动脉中制备脱细胞基质(ECM)的实验研究

薛锦儒,冯永刚,王图慧,韩春山

(吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033)

*通讯作者

从猪主动脉中制备脱细胞基质(ECM)的实验研究

薛锦儒,冯永刚,王图慧,韩春山*

(吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033)

脱细胞基质亦名细胞外基质(ECM)是广泛存在于动物组织器官中的纤维组织，主要由Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ型胶原，丝蛋白，纤维素和壳聚集糖等物质构成，包括取自小肠的SIS和取自膀胱的UBM[1,2]。由于ECM不存在细胞成分，因此没有免疫原性，这是用ECM构建组织器官的前提条件之一。同时ECM来源的组织不同，其所携带的生物信息也不同，在构建组织器官时，相同胚层起源的组织所携带的生物信息相近，对于恢复新建组织器官的功能更为有利。国内外广泛应用ECM修复、重建组织器官，尤其在组织工程领域，ECM是极佳的组织支架材料，为种子细胞的生长提供了良好的基础[3,4]。与消化道、呼吸道重建不同，用ECM重建心血管器官具有一定的特殊性：①ECM要更坚固，在重建的主动脉或左心室上要承受较大的压力；②光滑度要求更高，以防止附壁血栓的形成；③边缘要有足够的韧度，以免缝合时边缘缝针处撕裂，造成漏血。我们从猪的主动脉中成功制取了ECM，并用此种ECM修复左心室，同时以猪小肠中制取的SIS进行对照研究。

1 材料与方法

1.1 猪主动脉ECM的制取

地产白猪10头，体重100-150 kg，本市屠宰场获取，缺血时间在20 min以内，取出后立即浸入4℃生理盐水中，并以生理盐水洗净。将主动脉平整铺在操作台上，侧面剪开，以眼科剪刀仔细剪开主动脉内膜，尽可能多地剪开小口，将主动脉内膜分块剔除。肋间动脉开口处以11号手术刀片仔细刮除内膜以防止细胞残留。将主动脉翻转，以眼科剪刀剪除主动脉外膜，中层平滑肌上剪开尽可能多的小口，以有机玻璃板仔细刮除平滑肌层，保留完整的猪主动脉ECM。将猪主动脉ECM三层折叠、双面以玻璃加压，使其紧密相贴，真空干燥。

1.2 猪小肠SIS的制取

在切取主动脉的同时，取同体猪小肠50 cm，取出后立即浸入4℃生理盐水中，洗净肠内容。将小肠按10 cm长度剪成段，平整铺在操作台上，侧面剪开，以眼科剪刀仔细剪开小肠黏膜，尽可能多地剪开小口，将肠黏膜刮除。将小肠翻转，以眼科剪刀剪开浆肌层，仔细刮除浆肌层，保留白色、半透明、菲薄的SIS。将猪小肠SIS三层，以前述之方法折叠、加压、干燥。

1.3 动物实验研究

地产白猪10头，体重35±3.9 kg,分为两组，ECM组5头，SIS组5头。肌注Ketamine(1 mg/kg)诱导麻醉，心电监测，血氧饱和度监测。胸部正中切口，劈开胸骨，剪开心包，显露心脏。右心房注射肝素200 U/kg体重，主动脉和右心房分别插管，接人工心肺机并行循环。左冠状动脉第二对角支以6号Proline线缝扎，造成左室前壁小区域心肌梗死。根据心梗范围，修剪ECM/SIS补片使其大小与梗死范围相符，将补片预缝4-0 Proline 线8针。以11号刀片切除左室前壁梗死区，将补片缝在左室缺损处，针从心腔内缝出，加垫片在心外膜结扎。停止人工心肺机并行循环，拔除主动脉和右心房插管，胸骨后放置引流，关胸。术后抗菌素(头孢氨苄30 mg/kg)预防感染，次日拔除胸骨后引流管，术后观察一个月处死存活动物。

2 结果

ECM组3例动物顺利完成手术并存活一个月，1例术中死于心室纤颤，另一例术后一周死于心力衰竭。SIS组2例顺利完成手术，2例于术中出现SIS补片缝合缘漏血，死于失血性休克。1例存活至术后5天，活动中出现SIS补片破裂而猝死。

存活到一个月的5例动物，以静脉注射氯化钾的方式处死。切取心脏左室补片部位，HE染色，光镜下观察：两组左心室补片与左心室心肌结合部位连接致密，无漏血现象；心肌细胞已经沿着补片边缘向中心生长，ECM组自边缘向中心生长3.53±0.21 mm；SIS组自边缘向中心生长2.1±0.31 mm (P<0.05)。

3 讨论

脱细胞基质(ECM)携带原有器官的生物信息已经为国外的研究所证实[5]，这些生物信息储存在胶原和纤维当中，与胚胎起源有关，也与组织器官的生物进化和功能训练有关，譬如取自小肠的SIS，用其修复需要蠕动的器官更有优势。取自主动脉的ECM,用其修复心脏或大血管更佳。

比较两种补片的坚固性，取自主动脉的ECM较之取自小肠的SIS更为坚固，前者未出现破裂现象，后者则出现一例。在补片边缘缝针部位的坚固程度来看，ECM补片更坚韧，缝针处无裂伤，SIS补片边缘缝针处出血明显，2例因出血而死。说明同为三层的脱细胞基质，制备工艺完全相同的情况下，在耐受压力和坚韧程度上，SIS补片均逊于ECM补片。而在两种补片诱导心肌细胞爬行生长方面，ECM补片明显优于SIS补片，细胞在其表面生长的速度更快，说明在修补心血管时宜采用取自主动脉的ECM。

[1]李春霖，薛锦儒，吴金凤，等.猪天然管状SIS人工食管的制备和不同灭菌方式的比较[J].中国实验诊断学，2013，17(1)：15.

[2]Piccoli M,Urbani L,Alvare-Fallaas ME.Improvement of diaphragmatic performance through orthotopic application of decelluarized extracellular patch[J].Biomaterials,2016，74:245.

[3]李春霖，薛锦儒，崔建华.猪小肠与犬食管脱细胞基质(ECM)构建组织工程化人工食管的比较研究[J].中国实验诊断学，2013,17(2)：207.

[4]吴金凤，薛锦儒，崔建华.用猪小肠细胞外基质膜(ECM)修复家兔缺损胸壁的实验研究[J].中国实验诊断学，2011，15(10):1643.

[5]崔建华，郝 斌，孟晓萍.猪多层细胞外基质(ECM)人工食管的动物实验研究[J].中国实验诊断学，2009,13(2)：173.

1007-4287(2017)03-0484-02

2016-07-14)