甜叶菊繁殖方式研究进展

杨传辉，邓镇涛

（遵义医学院珠海校区生物工程系，广东珠海519041）

甜叶菊繁殖方式研究进展

杨传辉，邓镇涛*

（遵义医学院珠海校区生物工程系，广东珠海519041）

综述了甜叶菊在种子繁殖、扦插技术、组织培养、原生质体培养及人工种子技术等方面的研究进展，以期为更好地利用这种优良的高糖植物提供参考。

甜叶菊；植物繁殖方式；高糖植物

甜叶菊为一种富含甜菊糖苷的菊科甜叶菊属植物，其甜度是蔗糖的300倍[1]，而热量仅为蔗糖的1/300[2]。作为天然甜味剂的甜菊糖苷因味美安全、甜度高热量低且可降低糖尿病[3]、高血脂[4]和高血压[5]等的发病率[6]，有着显著的药理作用等特点，逐渐成为一种深受饮料、食品、医药和日用化工等用糖行业欢迎的新糖源[7]。因其拥有巨大经济效益和药用潜力价值，甜叶菊日益受到人们的关注。仅依赖种子繁殖甜叶菊不能很好地为世界甜叶菊市场提供充足的原料，近年来通过不断发展扦插技术、组织培养技术及人工种子技术等，从多方面弥补甜叶菊种子繁殖的不足。

1 种子繁殖

用种子繁殖为有性繁殖。甜叶菊为雌雄同株异花授粉的两性花植物，栽培当年即能开花结实，用种子进行有性繁殖是甜叶菊育苗的一种重要方法。甜叶菊种子包括胚、种皮、子实皮、冠毛4部分，是一种长3～4mm，宽0.5～0.8mm的纺锤形瘦果，带有白褐色纵纹的黑（棕）色果皮上不仅有纵沟且刺毛密生[8]。

体积较小的甜叶菊种子多是采用播种育苗后移栽的方法繁殖。种子呈深褐色且冠毛张开时便已成熟、开始采收，将经过充分干燥的种子放在厚布袋中，于阴凉干燥通风处贮藏[9]。因无休眠期的甜叶菊种子发芽率会随着贮藏期增长而下降，因而不宜长期贮藏，最好当年播种。挑选黑褐色成熟饱满种子经晒干、搓去冠毛、消毒杀菌、湿润后开始催苗，待两三天后种子出芽萌发后即可播种。以150g/亩（667m2）的播种量将种子与泥沙均匀混合后均匀撒种，覆细肥土，种子与土层轻触，并保持土壤湿润。待萌发后50d左右种子长出几对真叶后开始移栽。移植后的大田栽植密度约为8000株/亩[10]。

甜叶菊种子发芽率主要受到湿度、温度、土壤肥料、种源的影响。近年来通过一些对甜叶菊种子萌发率影响的试验研究得出低剂量的氮离子束辐照[11]、种子去冠毛处理[12]、低浓度的盐胁迫[13]均可促进种子萌发。但目前种子萌发率低导致成本高的问题仍存在，因此如何选育优良品种和进一步提高萌发率显得尤为重要。

2 扦插繁殖

扦插育苗是甜叶菊繁殖的重要手段，经济、简单易行，且能保持母本优良性状。甜叶菊春季插条从越冬老根的幼苗获得，秋冬季插条可从秋繁苗上截取，由于插条不易存放，应随剪随插。扦插取材部位以带有3～5对叶片的粗壮嫩枝为佳，扦插基质用河沙最好，搭棚遮阴，保温保湿。扦插时间一般在春季3—5月和秋季8—10月为宜。扦插苗的株行距为2cm×3cm，扦插深度以1.5～2cm为宜，一般提供85%左右的空气相对湿度和25℃左右的苗床温度为宜[10]。一般甜叶菊插条需12d左右生根，用低浓度的萘乙酸蘸根浸泡插条6～8h有利于生根，且成活率提高[14]。此外，甜叶菊为宿根性作物，越冬保温保存萌发新茎的老根亦可在翌春时将新茎分株移栽[13]。

3 组织培养

组织培养具有繁殖种苗周期短、繁殖速度快和繁殖系数高等优点，可在短期内获得大量种苗，且能保持种苗的遗传稳定性，是科学研究和生产栽培中的重要手段[15]。甜叶菊组织培养的程序主要包括“外植体选择—消毒—接种—愈伤组织及芽的诱导—叶继代培养及丛生芽的增殖—生根诱导—炼苗—移栽”等步骤。甜叶菊组织培养通常是在MS培养基的基础上，加上适量的6-BA、NAA、IAA等激素作为芽诱导、继代和生根培养基[16]。试管苗通过炼苗后移栽极易成活。郝再彬等人研究了不同外植体、不同激素种类和配比对愈伤组织诱导、不定芽分化和生根的影响。数据表明：以茎尖为外植体诱导愈伤组织和不定芽效果最佳；带腋芽茎段的效果稍差；叶片诱导效果最差[17]。

茎尖的组织培养是取甜叶菊茎尖，接种于含有不同浓度6-BA和NAA的MS培养基中，以MS+6-BA 1.0mg/L的培养基为宜。培养约20 d后茎尖长成丛生芽，当外植体茎尖长出多个1～2cm的不定芽时，分割芽苗接种于MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05 mg/L的培养基上；当芽苗伸长到2 cm左右时，可分离出无根芽苗培养到1/4MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L NAA+1g/L活性炭的培养基上诱导生根[18]，约10d左右形成根。

茎段的组织培养是取甜叶菊的有节茎段为外植体进行组织培养。其适宜的芽诱导培养基为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.2mg/L，继代增殖培养基为MS+6BA 0.6mg/L+NAA 0.2mg/L，增值系数4～6，增值周期15～20 d，生根培养基以1/4 MS+NAA 0.2mg/L为宜。在此条件下，甜叶菊的诱导增殖、继代培养、生根及移植成活率都较高[18]。

通过浓度为0.1%的升汞 （HgCl2）和75%左右的酒精灭菌消毒的甜叶菊外植体基本上即可达到无菌效果。郝再彬等人采用将茎尖叶片等外植体先用蒸馏水洗净后用70%的酒精消毒l0s，再用0.1%的HgCl2溶液浸泡4min达到了较好的灭菌效果[17]。刘学敏等人采用75%酒精4s+0.1%HgCl24min的灭菌方法，愈伤组织诱导率高达86.7%[19]。Hemant等人采用体积比为15%的漂白剂+0.1%的TWEEN20消毒20min或经过0.5%的次氯酸钠溶液灭菌亦可达到较好灭菌效果[20]。

4 原生质体培养

通过对甜叶菊的细胞培养获得再生植物。细胞培养的细胞来源于甜叶菊叶或幼茎组织培养所产生的愈伤组织，舒英杰等人已经从甜叶菊叶片获得原生质体[21]。C.M.Ferreira等人也已经从甜叶菊叶得到松散的愈伤组织，并完成了细胞的悬浮培养及离体保存等技术过程[22]。原生质体经液体悬浮培养，再转移到固体培养基上，最后培养分化成完整的植株[23]。由于甜叶菊细胞培养所需的成本较高且技术过程复杂，在生产上难以形成规模化应用。

5 人工种子技术

人工种子不但可保持优良品种的遗传特性，还能够保存及快速繁殖脱毒苗，还能提供更好的营养物质影响其生长抗性。以甜叶菊茎尖和丛生芽节段为体细胞胚，采用3%的海藻酸钠作为凝胶基质在100mmol/L的氯化钙溶液中凝固15min，得到硬度、湿度合适的甜叶菊人工种子，未萌发的种子经200mmol/L KNO3溶液（含有1mg/L的BAP）浸泡5min有助于萌发，且Aamir Ali等研究表明甜叶菊人工种子萌发率会随着储藏时间的增长而降低，甜叶菊人工种子保存15d以内为宜[24]。芽从外植体腋芽增殖再生，茎段丛生芽在MS+1 mg/ L 6-BA培养基中的诱导率最高，在MS+0.2 mg/L IAA培养基中，可得最大数量的根[25]。

6 问题与展望

作为重要的经济作物，甜叶菊近年来备受关注。国内外甜叶菊繁殖方式研究已开展多年，扦插、组织培养等无性繁殖技术与理论非常成熟；原生质体培养、人工种子繁殖等技术过程复杂成本高，仍处于研究阶段，未形成规模化生产应用，但前景广阔。倘若能够将原生质体培养与组织培养等技术相结合研究出新的快繁技术，有望为甜叶菊的快繁开辟新的方向。

[1]Chalapathi，M.V.，and S.Thimmegowda.Natural non-calorie sweetener stevia(Stevia rebaudiana Bertoni):A future crop of India Crop[J].Research Hisar,1997,14(2):347-350

[2]Midmore，D.J.，A.H.Rank.A new rural industry—Stevia—to replace imported chemical sweeteners[Z].Borton，MA:Report for the Rural Industries R&D Corporation,2002

[3]Shukla S，Mehta A，Mehta P，et al．Evaluation of comparative antidiabetic effects of ethanolic extracts of Caesalpinia bouncucella and Stevia rebaudiana in normal and alloxan-induced experimental rats[J].Romanian Biotechnological Letters，2011，16(3):6187-6199

[4]Sharma N M R，Upadhyay B．Effect of stevia extract intervention on lipid profile[J].Stud．Ethno-Med，2009,3(2):137-140

[5]Hsu Y H，Liu J C，Kao P F，et al.Antihypertensive effect of stevioside in different strains of hypertensive rats[J].Chinese Medical Journal，2002，65(1):1-6

[6]曹芳，冯文静，陈明，等.甜菊糖苷降血糖作用研究[J].中国药物与临床，2009，9（2）：127

[7]尚宏芹.甜叶菊综合利用研究进展[J].生物学教学，2011，36（2）：4-6

[8]谭德云，陈祥梅，谭德新，王德宝.甜菊种子特征及高效育苗技术[J].中国糖料，2003，25（1）：34-36

[9]李瑞锋.甜叶菊种子高效生产技术[J].中国糖料，2009，31（3）：52-53

[10]周群喜，杨秋萍.甜叶菊繁苗技术[J].种子科技，2012，30（5）：40-42

[11]阂笛，陈达伟，苏婷婷，汤其坤，王钰.低能N+离子束辐照甜叶菊种子的当代效应研究[J].生物学杂志，2013，30（5）：41-43

[12]陈叶，郝宏杰，王治江，等.不同处理对甜叶菊种子出苗率和幼苗生长的影响研究[J].种子，2012，31（4）：102-104

[13]梁飞林，郝宏杰，田世华，陈叶，罗光宏.NaCl对甜叶菊种子萌发及幼苗生长的影响[J].中国种业，2013（9）：65-67[14]殷学云.河西冷凉灌区甜叶菊扦插育苗及根蘖繁殖技术[J].中国糖料，2011，33（1）：52-54

[15]刘书荣，刘静，吴曼.植物组织培养及其在果树上的应用[J].现代农业科技，2011（22）：45-46

[16]M.Thiyagarajan,P.Venkatachalam.Large scale in vitro propagation of Stevia rebaudiana(Bert)for commercial application: Pharmaceutically important and antidiabetic medicinal herb[J].Industrial Crops and Products，2012，37(1)：111-117

[17]郝再彬，董振红，李子院.高品质甜叶菊品系“1096”的组培快繁[J].中国糖料，2011，33（3）：9-11

[18]刘家胜，高晓慧，赖桂秀，梁益华.甜叶菊组培快繁与工厂化育苗技术[J].生物技术世界，2015（3）：21

[19]刘学敏，尚宏芹.甜叶菊叶片灭菌方法的研究[J].黑龙江农业科学，2014（3）：19-21

[20]Hemant Lata，Suman Chandra，et al.TDZ-Induced High Frequency Plant Regeneration through Direct Shoot Organogenesis in Stevia rebaudiana Benoni:An Important Medicinal Plant and a Natural Sweetener[J].American Journal of Plant Sciences，2013, 4(1):117-128

[21]安徽科技学院.一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法：中国专利，CN 105385649 A[P].2016-03-09

[22]C.M.Ferreira，Walter Handro.Production，maintenance and plant regeneration from cell suspension cultures of Stevia rebaudiana (Bert)Bertoni[J].Plant Cell Reports,1988,7(2):123-126

[23]Shaifali Mathur，Gyan Singh Shekhawat.Establishment and characterization of Stevia rebaudiana(Bertoni)cell suspension culture: an in vitro approach for production of stevioside[J].Acta Physiol Plant，2013,35(3):931-939

[24]Aamir Ali，Irum Gull,Abdul Majid,Asif Saleem,Shagufta Naz and Naima H.N.In vitro conservation and production of vigorous and desiccate tolerant synthetic seeds in Stevia rebaudiana[J].Journal of Medicinal Plants Research，2011，6(7)：1327-1333

[25]Ahmed Abbas Nower.In Vitro Propagation and Synthetic Seeds Production:An Efficient Methods for Stevia rebaudiana Bertoni[J]. Sugar Tech，2014，16(1)：100-108

Research Progresses on Reproduction Modes of Stevia

YANG Chuan-hui,DENG Zhen-tao*
(Bioengineering Department of Zhuhai Campus,Zunyi Medical College,Zhuhai Guangdong 519041)

The research progresses such as seed propagation,cutting techniques,tissue culture,protoplast culture,and artificial seed technology of Stevia were reviewed in this paper,to expect to provide a reference for research and application of Stevia.

Stevia;reproduction mode of plant;high sugar plant

S566.9

B

1007－2624（2017）01－0065－02

10.13570/j.cnki.scc.2017.01.020

2016-08-17

杨传辉（1996-），男，山东省济宁市梁山县人，Email：1714812198@qq.com

邓镇涛，遵义医学院珠海校区教师。Email：19722057@qq.com