SCoT标记在甘蔗上的创新利用

吴建明，黄 杏，丘立杭，陈荣发，李杨瑞*，甘崇昆

（1.农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室，广西南宁530007；2.广西农业科学院甘蔗研究所，广西南宁530007；3.中国农业科学院甘蔗研究中心，广西南宁530007；4.崇左市农业局土肥站，广西崇左532500）

SCoT标记在甘蔗上的创新利用

吴建明1，2，3，黄 杏1，2，3，丘立杭1，2，3，陈荣发1，2，3，李杨瑞1，2，3*，甘崇昆4

（1.农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室，广西南宁530007；2.广西农业科学院甘蔗研究所，广西南宁530007；3.中国农业科学院甘蔗研究中心，广西南宁530007；4.崇左市农业局土肥站，广西崇左532500）

SCoT是一种新型的分子标记，2009年开发以来已经成功应用于种质资源亲缘关系的鉴定、发育进化分析、遗传图谱的构建、基因差异表达分析等诸多研究领域。作者根据SCoT技术原理，首次将SCoT标记应用于甘蔗基因差异表达分析，结合自身研究结果对SCoT标记在甘蔗上的研究应用现状进行综述，并就SCoT技术应用于基因差异表达所面临的挑战和未来发展前景进行了分析与讨论，以期为科研工作者在甘蔗分子标记的选择上多一种参考依据。

甘蔗；分子标记；SCoT；差异表达

SCoT（Start codon targeted）标记具有单引物、操作简单、费用低等特点，2009年，SCoT分子标记自诞生之日起，就引起了生物科学家们极大的兴趣[1]。作者根据SCoT技术原理，首次成功应用SCoT标记对甘蔗进行基因差异表达分析，并新开发了34条引物[2]。目前，关于SCoT标记的相关研究已经有大量的报道，已成功应用于包括果树、经济作物、粮食作物、中草药、花卉等多种植物，研究的内容涉及种质资源鉴定、遗传多样性分析、遗传图谱构建、抗性、差异表达分析等多个领域。SCoT标记广泛应用以来日趋成熟、完善。目前，已经和一些最常用的分子标记进行比较分析，该技术具有稳定可靠、操作简便、成本低、引物少等显著优点，在多方面研究领域取得了较大的进展。SCoT标记在遗传育种、物种亲缘关系鉴别、基因组作图、基因定位、基因库构建和基因克隆等方面将突显更重要作用。SCoT标记在甘蔗的抗病、抗寒、抗旱、遗传进化等方面得到研究应用。本文对SCoT标记在甘蔗上研究应用现状进行综述，以期为科研工作者在选择分子标记技术研究方面多一种选择提供参考。

1 SCoT标记在甘蔗上反应体系筛选研究

SCoT标记目前开发的引物可以在不同物种间通用，但不同物种之间模板、引物、dNTPs、Taq酶和Mg2+均对扩增结果产生或多或少的影响。因此不同的反应体系筛选研究能给研究同一物种的工作者提供重要参考依据，减少试验次数和节省试验费用。苏亚春等[3]（2012）采用L16（45）正交实验设计，探讨了模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物及Taq酶5个因素对甘蔗SCoT-PCR扩增效果的影响，建立了甘蔗SCoT-PCR的优化反应体系，并对多态性引物进行了筛选。本课题组对甘蔗cDNA-SCoT差异显示PCR反应的cDNA模板、SCoT引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg2+等因子进行优化，建立甘蔗cDNA-SCoT反应体系[4]。徐刚红等[5]以甘蔗黑穗病菌交配型菌株基因组DNA为模板，在单因素优化试验的基础上，采用L16（45）正交试验设计，对影响甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、rTaq DNA聚合酶和模板用量5个因素进行优化，建立优化的甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系。从前人的研究结果对比可看出，除dNTP和引物浓度比较一致外，其他因素差异还是比较大。这可能是由于不同研究者使用不一样的模板（DNA和cDNA）或不同筛选方法或不同甘蔗品种所致。

2 SCoT标记在甘蔗上检测方法比较研究

聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，只有变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶两种形式，且分辨力小；琼脂糖凝胶的凝胶孔径大，适合大分子DNA电泳和需要快速简单分析的DNA电泳，电泳方式一般采用水平潜水电泳。优点是快速简单，但分辨率不是很高，对于差异较小的DNA片段难以分辨。可根据不同实验要求进行选择。陈香玲等[6]对cDNA-SCoT琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种检测方法进行比较分析，结果表明，聚丙烯酰胺凝胶电泳中，cDNA条带呈黑褐色，背景为浅黄色，主带和弱带清晰易读，琼脂糖凝胶条带亮白，背景为黑色，主带明显，副带较模糊。陈荣发[7]也对cDNA-SCoT琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种检测方法进行比较分析，其结果也基本一致。从两者的研究结果可发现琼脂糖凝胶模糊的带，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测可以清晰分辨；且聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测到琼脂糖凝胶肉眼看不到的带。说明聚丙烯酰胺凝胶更容易筛选差异表达片段，如果条件允许建议用聚丙烯酰胺凝胶筛选差异表达基因。

3 SCoT标记在甘蔗上研究应用现状

3.1 SCoT在甘蔗遗传多样性的研究

2009年SCoT成功应用于水稻之后，该标记已经广泛应用于花生、芒果、玉米、菠萝等植物，近年该技术也在甘蔗中得到应用研究。宋焕忠等[8]利用SCoT分子标记技术对采自广西的50份斑茅无性系进行遗传多样性分析，从46条引物中筛选出扩增结果稳定、条带清晰和有多态性的引物15条，扩增位点336个，其中多态性位点284个，多态性为83.93%。陈平华等[9]利用SCoT分子标记检测甘蔗单花粉粒间多态性，结果显示，单花粉粒间的基因位点的变异程度随使用的SCoT引物不同而存在差异。有些引物扩增具有高度变异性、有些引物扩增的片段比较大、有些引物扩增的基因位点保守性强。说明SCoT分子标记技术完全适用于甘蔗遗传多样性的分析，只是不同引物扩增结果差异较大，需要对引物进行筛选。

3.2 SCoT标记应用于转录组差异表达分析

3.2.1 cDNA-SCoT应用于霉素诱导甘蔗节间伸长的差异表达 根据SCoT技术原理，作者首次成功应用SCoT标记进行赤霉素诱导甘蔗节间伸长的差异表达分析。结果表明，通过46条引物筛选了约700个cDNA片段，获得差异片段30个。有18个基因片段受赤霉素上调而12个基因片段下调；其中16个TDFs序列和NCBI数据库中已录入的基因具有较高的相似性，按照其功能可分为6类，即能量与代谢相关基因（占总数的20.0%）、未知功能蛋白（占总数的20.0%）、未知基因（占总数的46.7%）、信号传导相关基因（占总数的6.7%）、转录因子相关基因（占总数的3.3%）和细胞凋亡基因（占总数的3.3%）[10]。随后，作者首次利用cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT三种技术结合分析赤霉素诱导甘蔗节间伸长的差异表达，结果表明，不同技术扩增结果各有特点，但不同技术也能扩增出相同基因差异片段，如GID1、1，3，4-trisphosphate 5/6-kinase、S-adenosylmethionine、hypothetical protein、Ribosomal gene等[11]。说明cDNA-AFLP、cDNA-SRAP和cDNA-SCoT技术均是研究基因差异表达的重要工具，但各技术在原理、方法、结果等方面均有各自的优缺点，研究者可以根据不同的研究方向和目的选择自己需要的方法或不同方法结合应用。

3.2.2 cDNA-SCoT应用抗逆性研究 植物可以利用自身的功能来适应外界环境的胁迫。在逆境条件下，表现出明显的时空特异性、组织特异性和条件诱导性的基因表达；在生理生化上做出反应，表现出的抗寒、抗冻、抗盐、抗病虫害等性状。根据这些特性，通过对不同细胞在不同状态及不同分化阶段的基因表达差异，可以发现与抗性相关的基因。陈香玲等[12]选用了桂糖28号（强抗寒性）和新台糖22号（弱抗寒性）两个甘蔗品种，分别构建了低温处理与对照的RNA混合池，利用cDNA-SCoT法进行了差异显示研究。结果，102条SCoT引物扩增出600多条带，长度在100～1800bp之间。两个甘蔗品种在低温下有部分相同的基因表达，5个TDF分别与脱水素、半胱氨酸型肽酶、多胺氧化酶、C4磷酸羧化酶和过氧化氢酶基因具有很高的同源性，只在抗寒品种中稳定出现的两个TDF功能未知，可能与甘蔗的抗寒基因表达相关。陈荣发[7]采用水培系统培养甘蔗幼苗，并于人工气候室在4℃下进行低温处理，以25℃培养为对照，分别在处理后1 d、3 d、5 d和7 d取样，构建处理与对照的RNA混合池，利用cDNA-SCoT法进行差异显示研究。结果表明，15条引物扩增出了43条特异条带，长度在100～750 bp之间，获得22条稳定的EST序列，5个与已登记的基因具有较高的同源性，其他17个特异片段的序列未能找到同源信息。两者使用同一技术分析同一甘蔗品种，获得的差异基因片段既有相同的，也有差异的片段。这些研究结果进一步证实了该技术的有效性。获得不同差异片段可能是由于分析的部位和处理的时期不一样导致。

植物的抗旱性是一个复杂的过程，涉及多个生理因素的作用，也受到多个基因共同作用导致。目前常用研究基因差异表达的方法如mRNA差异显示技术、SSH、SAGE、cDNA-AFLP、cDNA-SRAP等均已经应用于不同植物的抗旱性差异表达研究。cDNA-SCoT是近年发展起来的新技术，吴凯朝[13]使用cDNA-SCoT差异显示方法分离得到135个TDFs，可以分为14类：新陈代谢、能量代谢、运输途径、通信及信号转导、细胞循环及DNA加工、转录调控因子、蛋白质合成、蛋白质加工、结合功能蛋白、转座子、毒性及质粒蛋白、细胞分生物合成、防御和未分类蛋白。虽然得到了很多的差异片段，但是要证实哪些基因与抗旱性相关还需要进一步进行功能验证。

陈明辉等[14]构建宿根矮化病侵染处理与对照的RNA混合池，利用cDNA-SCoT法进行差异显示研究。结果表明，80条SCoT引物扩增出500多条带，长度在100～1800 bp之间。获得22条高质量的EST序列，主要涉及能量代谢、防卫反应、信号转导、蛋白质类代谢等方面。进一步基因功能分析显示，油菜素内酯合成蛋白、NBS-LRR类抗性蛋白、茉莉酸诱导蛋白、α-微管蛋白、ABA胁迫成熟蛋白、富含脯氨酸蛋白、翻译起始因子eif-2b α亚族等可能参与了甘蔗宿根矮化病病原菌互作的过程。从这些研究结果可以看出，SCoT技术首次成功应用于甘蔗差异表达分析后，已在甘蔗的节间伸长机理、抗寒、抗旱、抗病等方面得到进一步研究应用。目前，该技术除了甘蔗以外已在芒果[15]、西瓜[16-17]、大豆[18]、花生[19-20]、柑橘[21]、铁皮石斛[22]等植物上得到广泛应用，且得到了较好的进展。

4 展望

随着分子生物学不断发展，越来越多的技术应用于基因差异表达分析，如mRNA差异显示、SSH、SAGE、cDNA-AFLP、cDNA-SRAP、cDNA-SCoT等技术。这些技术广泛应用于如不同发育时期、生理生态或病理过程中的基因表达分析，且已经分离了影响这些过程的相关基因。这些基因的获得为分子育种奠定了基础。虽然cDNA-SCoT作为一种新差异表达技术已经成功应用于多种植物分析，但它如今却碰上了一个强劲对手——RNA-Seq，因该技术具有定量更精确、可重复性更高、检测范围更广、分析更可靠等特点。此外，RNA-Seq还能发现新的转录本、SNP、剪接变体，并提供等位基因特异的基因表达。但RNA-Seq技术也存在一些新问题，一是数据量的庞大如何更好地诠释？二是需要较多的样品起始量，这就使得来源极为有限的生物样品受到限制[23]；三是RNA-Seq技术费用比较高，对一些小课题及基础条件较差的地方比较难普及。虽然这些技术都已经很成熟且应用于各方面的研究，但不同技术在原理、方法、结果等方面均有各自的特点，就选择某一种技术而言，要根据具体情况如基因组大小、RNA提取量多少、实验目的、实验条件、课题经费等条件而决定。当然如果条件允许，应利用不同技术结合应用将获得更全面的基因表达信息，也可以对不同差异表达技术扩增结果加以相互印证，这在作者的研究结果已经得到证实[9]。

[1]Collard B C Y，Mackill D J.Start codon targeted（SCoT）polymorphism：A simple，novel DNA marker technique for generating gene -targeted markers in plants[J].Plant Molecular Biology Reporter，2009，27（1）：86-93.

[2]吴建明，李杨瑞，王爱勤，等.赤霉素诱导甘蔗节间伸长基因的cDNA-SCoT差异表达分析[J].作物学报，2010，36（11）：1883-1890.

[3]苏亚春，凌辉，王恒波，等.甘蔗SCoT-PCR反应体系优化与多态性引物筛选及应用[J].应用与环境生物学报，2012，18（5）：810-818.

[4]吴凯朝，李杨瑞，杨丽涛，等.甘蔗cDNA-SCoT差异显示分析PCR反应体系建立、优化及应用[J].热带作物学报，2013，34（5）：892-898.

[5]徐刚红，姜子德，沈万宽，等.甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系优化与引物筛选[J].华中农业大学学报，2015，34（6）：33-39.

[6]陈香玲，李杨瑞，杨丽涛，等.cDNA-SCOT基因差异表达两种电泳方法的比较研究[J].生物技术通报，2010（10）：93-95.

[7]陈荣发.低温胁迫对甘蔗幼苗根系基因差异表达和线粒体生理生化作用的影响[D].南宁：广西大学，2012.

[8]宋焕忠，张荣华，杨海霞，等.广西斑茅遗传多样性的SCoT标记分析[J].西南农业学报，2014，27（1）：59-64.

[9]陈平华，陈如凯，许莉萍，等.甘蔗单花粉全基因组扩增（WGA）与SCoT分子标记研究[J].热带作物学报，2011，32（11）：2069-2075.

[10]Jian-Ming Wu，Yang-Rui Li，Li-Tao Yang，Feng-Xue Fang，Huan-zhong Song，Hong-QinTang，Miao Wang，Meng-Ling Weng. cDNA-SCoT：A novel rapid method for analysis of gene differential expression in sugarcane and other plants[J].Australian Journal of Crop Science，2013，7（5）：659-664.

[11]Jian-Ming Wu，Yang-Rui Li，Li-Tao Yang，et al.Differential expression analysis of gibberellin-induced stalk elongation genes in sugarcane（SACCHARUM HYBRID）by different technologies[J].International Journal of Science and Nature，2016，7（2）：235-243

[12]陈香玲，李杨瑞，杨丽涛，等.低温胁迫下甘蔗抗寒相关基因的cDNA-SCOT差异显示[J].生物技术通报，2010，21（8）：120-124. [13]吴凯朝.干旱和复水条件下甘蔗特异基因诱导表达及其克隆的研究[D].南宁：广西大学，2013.

[14]陈明辉，张保青，宋修鹏，等.宿根矮化病菌诱导甘蔗差异表达基因的cDNA-SCoT分析[J].作物学报，2013，39（6）：1119-1126.

[15]罗聪.芒果SCoT分子标记与逆境和重要开花时间相关基因研究[D].南宁：广西大学，2012.

[16]李朋飞.西瓜多倍体诱导及其分子生物学基础[D].保定：河北农业大学，2013.

[17]杨静，王萍，石磊.籽用西瓜SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选[J].西北农业学报，2016，25（6）：889-896.

[18]李强，苏二虎，高聚林，等.大豆SCoT分子标记技术体系的优化、验证及检测[J].中国油料作物学报，2013，35（5）：491-498.

[19]贺梁琼，熊发前，唐秀梅，等.花生属人工异源多倍体进化早期基因表达变化的cDNA-SCoT分析[J].作物学报，2014（10）：1767-1775.

[20]熊发前，蒋 菁，钟瑞春，等.目标起始密码子多态性（SCoT）分子标记技术在花生属中的应用[J].作物学报，2010，36（12）：2055-2061.

[21]韩国辉，向素琼，汪卫星，等.柑橘SCoT分子标记技术体系的建立及其在遗传分析的应用[J].园艺学报，2011，38（7）：1243-1250.

[22]李东宾，高燕会，斯金平.冷胁迫下铁皮石斛抗寒相关基因的SCoT差异表达分析[J].中国中药杂志，2013，38（4）：511-515.

[23]祁云霞，刘永斌，荣威恒.转录组研究新技术：RNA-Seq及其应用[J].遗传，33（11）：1191-1202.

Innovative Application of SCoT Markers on Sugarcane

WU Jian-ming1,2,3,HUANG Xing1,2,3,QIU Li-hang1,2,3,CHEN Rong-fa1,2,3,LIYang-Rui1,2,3*,GAN Chong-kun4
(1.Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement,Ministry of Agriculture,China,Nanning 530007;2. Sugarcane Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007;3.Sugarcane Research Center,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530007;4.Soil and Fertilizer Station,Chongzuo Agricultural Bureau,Chongzuo 532500)

According to the principle of SCoT,for the first time,SCoT markers was used to analyze the gene differential expression in sugarcane,combined own study,application status of SCoT markers on sugarcane were reviewed,and the challenges and development prospects of SCoT in differentially expressed genes was discussed, in order to provide more references for researchers to choose molecular markers on sugarcane.

sugarcane;molecular marker;SCoT;differential expression

S566.103；Q78

B

1007－2624（2017）01－0051－03

10.13570/j.cnki.scc.2017.01.017

2016-10-08

国家自然科学基金（31360312），广西自然科学基金重点项目（2015GXNSFDA139011），国家高技术研究发展计划863计划（2013AA102604），广西自然科学基金（2014GXNSFBA118087），国际科技合作计划（2013DFA31600），广西八桂学者专项基金（2013），广西农业科学院发展基金项目（2014YP03，2014YD02，2015YM13，2015YT03）。

吴建明（1978-），男，广西宁明县人，博士，副研究员，主要从事甘蔗分子生物学研究。E-mail：wujianming2004@126.com

李杨瑞（1957-），男，博士、广西壮族自治区终身教授、博士生导师，广西“甘蔗种质创新利用”岗位八桂学者，主要从事甘蔗栽培、育种和生物技术研究。E-mail：liyr@gxaas.net