表达CD20的正常B细胞对CD20特异cTCR+T细胞抗白血病活性的影响

任振波，候毅锐，郑 伟，张 雷，虞 微，黄 琳

(解放军第208医院，吉林 长春130062)

表达CD20的正常B细胞对CD20特异cTCR+T细胞抗白血病活性的影响

任振波*，候毅锐，郑 伟，张 雷，虞 微，黄 琳

(解放军第208医院，吉林 长春130062)

急性淋巴细胞白血病(ALL)为预后极差的一种类型急性白血病。既往治疗以化疗为主，生存期极短。造血干细胞移植(HSCT)为唯一能治愈本病的方法，但由于缺乏配型相合供体及资金等，HSCT也只能挽回少部分ALL患者的生命。近20年来国外研究的用嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)[1]治疗ALL已有成功的报道，且没有移植物抗宿主病副作用，具有广泛的应用前景，有取代HSCT成为治疗B-ALL、CLL、NHL的一种新的方法的趋势。

经过20多年的发展，CAR-T的设计已经越来越完善，但仍存在许多问题。如on-target效应(靶效应)(肿瘤溶解综合征、细胞因子风暴、巨细胞综合征、神经毒性、B细胞缺如及低丙种球蛋白血症)；off-target(脱靶效应)等。输注细胞前是否需要进行预处理及用什么方法进行预处理能否解决on-target效应还未确定。国内开展的中心很少。据Anupama Ahuja[2]报道鼠B细胞减少可以抑制系统性免疫反应，并研制了表达CD20的B细胞转基因鼠，应用大剂量鼠抗人CD20单抗导致B细胞明显减少，取得了明显的临床疗效。我们设想在输注CAR-T细胞前给予抗CD20抗体进行预处理减少B淋巴细胞，观察CAR-T细胞的活性及抗肿瘤效果。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞系

Thy1.2+野生型(WT)鼠，人CD20(hCD20)转基因鼠、Leu16+T细胞、CL4细胞TCR转基因鼠和Thy1.1+和Thy1.2+Bbalb/c鼠购自美国The Jackson Laboratory。hCD20特异cTCR+T细胞；MB185- hCD20/Thy1.1-ffLuc-Neo肿瘤细胞，Thy1.1+Leu16+CD8+T细胞，Leu16+CD8+T细胞，Thy1.1+Leu16+T细胞。

1.2 试剂和仪器

荧光偶联抗体：mCD4，mCD8，hCD20，Thy1.1，CD3，CD28购自BD Bioscience。

抗hCD20由ATCC(American type culture collection)。杂交瘤HB-9645用FRCRC(Fred Hutchinson cancer Reserch center)生物设备进行。流式细胞仪使用BD Bioscience的FACS(荧光激活细胞分离仪)；抗mCD20和抗hCD20单抗购自美国eBioscience。ELISA试剂盒为美国eBioscience公司产品。CD20- CAR-T细胞购自美国ATCC。

1.3 鼠骨髓和脾细胞的制备

用CO2将鼠窒息后摘取鼠淋巴结和脾脏，用40 μm滤网过滤产生单细胞悬液；骨髓(BM)骨髓通过RPMI1640冲洗股骨骨髓腔取得；血、淋巴结、BM和脾细胞用低渗液体溶解后用流式细胞仪分析。

1.4 过继转导及B细胞去除

白血病细胞在指数生长期时用PBS洗涤后置Hank’s平衡盐液中通过尾静脉注入鼠中。T细胞在刺激后的第4-5天通过尾静脉注入。静脉注射抗hCD20单抗200μg后测定CD20特异T细胞数量。

1.5 体外T细胞分析

用流式细胞仪通过测定DDAO+的百分数将TB细胞结合的CFSE+DDAO+的百分数分开以测定T细胞的百分数。

1.6 生物发光成像

给鼠腹膜内注射荧光素钾，然后用X线摄像，用生物成像软件分析发光成像资料，单位为光子/s/cm2/sr，并可对确定部位进行测定。

1.7 统计学处理

应用SPSS 16．0软件进行统计学分析，两样本均数的比较用t检验，多个样本均数的比较用方差分析。生存分析用Kaplan-Meie log-rank检测。以P<0．05为差异有显著性。

1.8 方法

1.8.1 将107Thy1.1+Leu16+T细胞通过静脉注入Thy1.2+WT鼠和hCD20鼠，7天后取鼠的脾细胞，用流式细胞仪分析Thy1.1+CD4和CD8供者细胞及鼠自身B细胞。

1.8.2 给WT鼠注射107Thy1.1+Leu16+CD8+T细胞，于24小时后注射2×107WT或hCD20脾细胞做对比。注射3天后检测血中(供者)Thy1.1+CD8+细胞。注射1周后取鼠脾细胞再测一次Thy1.1+CD8+细胞。

1.8.3 给WT鼠和hCD20鼠静脉注射2×107MB185- hCD20/Thy1.1-ffLuc-Neo白血病细胞。3天后注射Leu16+cTCR(治疗)及空载体转导的Thy1.1+CD8+T细胞，然后进行生物发光成像。

1.8.4 注射T细胞2天后抽取WT鼠和hCD20鼠的外周血检测Thy1.1+CD8+T细胞。实验重复2次，每组用鼠3-4只)。

1.8.5 注射T细胞2天后，对照白血病生物发光信号和外周血供者CD8+T细胞百分数。实验重复2次，每只WT鼠分别注射0.1、0.3、107 个Leu16+T细胞。

2 结果

2.1 将107Thy1.1+Leu16+效应T细胞注入WT鼠和hCD20鼠中1周后，Thy1.1+供者细胞在WT鼠脾中CD4细胞占3.5%；CD8细胞占4.8%，但在hCD20鼠中分别仅占0.02%(P<0.01)和0.008%(P<0.01)，提示在hCD20鼠中抗原特异性T细胞减少。

2.2 鼠自身B细胞的数量在hCD20鼠中和WT鼠的脾中是相似的(P<0.05)，说明T细胞减少限制了转入细胞的抗B细胞活性。

2.3 给WT鼠注射Leu16+T细胞，于24 h后注射2×107WT或hCD20脾细胞做对比。注射3天后，在注入hCD20脾细胞的WT鼠的血中与注入WT脾细胞的WT鼠相比，Thy1.1+供者细胞明显减少(1.32%:4.1%CD8+Thy1.1+；P<0.01)。

2.4 注射1周后，Thy1.1+供者细胞也减少(0.4%:2.4%CD8+Thy1.1+；P<0.01)。2.5 先给野生型(WT)鼠及hCD20鼠注射2×107白血病细胞，3天后再静脉注射107Leu16+CD8+T细胞，在WT鼠内3天白血病生物发光信号减弱，但在hCD20鼠中的白血病的生长极小受到影响(抑制)。

2.6 在Thy1.1+供者细胞中，在注入后2天的hCD20宿主中的血CD8T细胞仅占1.3%，而在WT宿主中为12.2%(P<0.001)。

2.7 用滴定法测量进入具有白血病的WT宿主中的Leu16+T细胞表明0.1-0.3×107Leu16+T细胞在WT宿主中与在hCD20宿主中的107Leu16+T细胞的效果一致。这些结果表明CD20特异T细胞在与正常B细胞反应时减少，而在与白血病B细胞反应时不减少。

3 讨论

嵌合型抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)是从肿瘤患者的血液或肿瘤组织中提取的T淋巴细胞，通过基因工程技术，采用特异性CAR转染后，进行体外培养增值，进而产生一定数量的、对某种肿瘤细胞抗原有特异识别功能的CAR-T细胞，再将CAR-T细胞回输到肿瘤患者体内，从而诱发抗肿瘤细胞作用，建立预防肿瘤复发的持久免疫力[3]。CAR-T通过抗原抗体结合的原理特异性识别肿瘤细胞表面的抗原，因此无主要组织相容性复合体(MHC)限制，还可以避免因肿瘤细胞MHC下调或丢失导致的免疫逃逸。而且通过在嵌合基因设计时增加共刺激分子信号，可增强CAR-T细胞的肿瘤杀伤活性。经过20多年的发展，CAR-T的设计已经越来越完善，手段也越来越多。

经过26年的研究，CAR-T技术已经发展出三代。第一代CAR-T在细胞内只有一个T细胞CD3ξ受体的信号区；第二代在第一代基础上增加了一个共刺激分子信号：第三代则在第一代基础上增加了2个共刺激分子信号。第一代CAR-T在体内存在时间太短且临床效果不佳。第三代CAR-T已被用于套细胞淋巴瘤及滤泡性非霍奇金淋巴瘤临床试验，但并未显示出比第二代更优越的临床结果。

目前在血液肿瘤临床应用上较为成功的主要是第二代CAR-T技术，转染的共刺激分子主要是CD28或CD137(4-1BB)。

注入的效应T细胞的持续存在已被证实为肿瘤过继T细胞免疫治疗效果的决定因素。临床实验调查过继输入cTCR+T细胞证明该T细胞仅短暂存在于有大量能产生抗原的病人体内[4,5]。与这些临床研究一致的是我们的结果显示正常B细胞表达CD20能降低CD20特异cTCR+T细胞的存活和功能，且提示抗体介导的B细胞减少可能是提高CD20特异T细胞治疗效果的有效方法。已证实正常B细胞可以使提呈给初始T细胞的抗原能力下降或数量减少[6,7]。相比之下，记忆性T细胞在应答B细胞表达的抗原时可以扩增[7]。CD20特异cTCR+T细胞在与正常B细胞应答时减少，表明B细胞表达的抗原的致耐受性潜能没有被之前激活的T细胞消除。虽然T细胞减少说明CD20特异cTCR+T细胞抗白血病功能在接触到表达CD20的正常B细胞之后有限性，在T细胞减少之前也许有其他机制限制T细胞功能。靶抗原在正常组织的高表达可以干扰T细胞的抗肿瘤功能，其过程是通过促进cTCR下调、T细胞脱敏以及通过增加全部抗原表达细胞减少体内效应器对靶目标的比例。因此，正常组织的抗原可能损害抗原特异T细胞的抗肿瘤功能，即使T细胞依然存活。

体外实验表明，正常人B细胞上高表达CD20抗原可以从CD20特异cTCR+T细胞表面下调cTCR分子[8]。正常TCR的下调可以降低效应器功能及敏感性[9]，表明cTCR下调可能限制对靶目标的识别。持续暴露于B细胞上的CD20分子也许能损害CD20特异cTCR+T细胞的存活。临床经验表明在有大量抗原负荷的病人血中cTCR+T细胞减少[4，5]。全淋巴细胞减少证明可以增加T细胞活性[10，11]，但在过继转入B细胞抗原特异的T细胞之前选择性B淋巴细胞减少的效果还未评估。虽然几个B细胞相关分子以TCRs为靶目标，包括CD19[12，13]，CD20[14，15]，CD22[16，17]，没有研究论及在模型机制中的体内cTCR+T细胞的功能，在此模型当中正常细胞和肿瘤细胞表达相同的靶分子。在此研究中，我们以免疫功能正常鼠中正常细胞和白血病细胞上的CD20为靶目标，正常B细胞上CD20的表达严重损害cTCR+CD8+T细胞介导的白血病免疫治疗，导致T细胞减少。在B细胞缺乏CD20的鼠中和用单抗的CD20B细胞减少的鼠中cTCR+T细胞转移至骨髓且除掉了白血病细胞。结果显示白血病模型鼠在T细胞输入之前B细胞减少可以提高B细胞抗原特异性cTCR+T细胞在体内的功能和存活。CD19抗原的变异，以及具有干细胞样特征的B-ALL起始细胞不表达CD19是应用CD20的原因。

综上所述，应用抗CD20单抗导致B细胞减少明显提高T细胞在白血病体内的活性及抗白血病效果，可以在人体内采用此预处理方法进行CD20特异cTCR+T细胞治疗急性B淋巴细胞白血病或B淋巴细胞淋巴瘤的临床实验。

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此项目受吉林省科技厅项目资助(项目编号20160101165JC)

1007-4287(2017)02-0326-03

2016-05-26)

*通讯作者