黑孢块菌与华山松合成菌根苗技术初探*

苏开美，张小雷，李富民，李娥贤，李树红**

（1.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650223；2.陆良县林业局，云南 陆良 655604）

黑孢块菌与华山松合成菌根苗技术初探*

苏开美1，张小雷1，李富民2，李娥贤1，李树红1**

（1.云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650223；2.陆良县林业局，云南 陆良 655604）

黑孢块菌（Tuber melanosporum Vittad.）是经济价值较高的菌根食用菌。通过对黑孢块菌与华山松（Pinus armandii Franch.）合成菌根苗的技术进行研究，结果显示，用黑孢块菌孢子液接种华山松树苗后，第7个月可观测到黄褐色外生菌根。外生菌根为单轴状或二叉分支状，单根菌根长0.3 mm～4 mm，直径为0.3 mm～0.5 mm，表面呈马赛克镶嵌结构，其外延菌丝为透明、半透明，呈近直角的分枝。菌根老化后变红褐色或萎缩。菌根表面呈马赛克镶嵌结构、外延菌丝有近直角的分枝是黑孢块菌与华山松形成菌根的最重要形态特征。

黑孢块菌；华山松；显微结构；共生真菌

黑孢块菌（Tuber melanosporum Vitt.），原产于欧洲地中海沿岸的法国、意大利及西班牙等国家[1]，是世界上最名贵的珍稀食用菌之一，也是世界上最昂贵的1种黑色块菌。由于黑孢块菌子囊果中不仅含有多种氨基酸、微量元素，更主要的是含有独特的香味化合物，成熟时其香味倍受人们喜爱。在法国、意大利是盛大宴会上款待宾客的佳肴，其价格不菲，1 000 g新鲜黑孢块菌售价高达1 500欧元以上[2]。欧洲人称它为森林中的“黑钻石”。由于其市场价格高昂导致人们过度采挖，造成资源锐减，供需矛盾突出。因此，开展块菌人工栽培技术研究，是近30年来倍受关注的国际性研究课题之一[2]。

块菌是1种菌根食用菌（ectomycorrhizal edible fungus），即共生型食用菌。由于这类食用菌生长必须与适宜宿主树木根系营共生生活，因此其栽培方法有别于腐生型食用菌，在人工栽培上有一定的困难度。法国、意大利和西班牙等国家，从上世纪70年代先后开始了块菌的人工栽培研究，并在1974年取得突破性进展，其中法国最早实现了块菌商业化生产，为菌根食用菌人工栽培提供了经验[3]。其主要方法是在温室条件下，通过人工接种培育带有块菌菌根的菌根化苗木，再将这些幼苗在适合林地上栽种，6年～7年后就可以长出黑孢块菌[3]。在黑孢块菌栽培的模式中，菌根化苗的合成与规模生产就成为其中关键技术之一。

中国至今未发现有黑孢块菌的分布，为了引种黑孢块菌，利用黑孢块菌的孢子接种中国的树种，研究其共生能力及形成菌根化苗的有关接种技术，2015年～2017年在温室条件下开展了有关研究。本文主要报道黑孢块菌对云南本土树种华山松幼苗的感染，以及形成菌根化苗木的有关接种条件，为在田间完成黑孢块菌的菌根合成奠定基础。栽培块菌，接种不同树种，栽种后出块菌的时间及产量是不同的[4]。栽培黑孢块菌常用的共生树种都是阔叶树，如壳斗科（Fagaceae） 和榛科（Corlysaceae） 的树种[2]，采用华山松作为黑孢块菌的寄主在世界上未见研究报道。本研究为黑孢块菌的人工栽培提供新的寄主植物，希望在中国引种黑孢块菌的研究中提供新的思路和途径。

1 材料和方法

1.1 无菌苗的培育

1.1.1 种子

2014年11月中旬从楚雄子溪山采回华山松种子，风干。

1.1.2 育苗基质

用蛭石与草煤，比例为1∶1（v·v-1）拌匀，含水量为60%，然后高温高压（121℃，1.5 kg·cm-2）灭菌[5]。

1.1.3 育苗

2015年2月10日左右在高8 cm，宽40 cm，长60 cm的盆钵中，装深6 cm的已经彻底灭菌的基质，华山松种子清水浸泡20 h左右，用0.3%的高锰酸钾溶液浸泡30 min后，清水冲洗干净，播种在准备好的基质里，再将灭过菌的基质撒在种子上，厚度1.5 cm，盆钵置于温室中保湿管理。

将以上方法培养的苗用干净透明胶片包裹后移植到内径为8 cm、高10 cm的育苗钵中，放入日温20℃～25℃、夜温18℃～20℃的自然光照塑料大棚内培养。培养期间，用无菌水浇润基质使维持在田间容水量。经培养约3个月后，苗木根系已大部分长至基质外围时，检验有无外生菌根污染，无污染的苗木可用于接种[5]。

1.2 菌种

来自新西兰的黑孢块菌子实体（图1B），粉碎，和无菌水混合制成孢子悬浮液（图1C）[6]。

1.3 菌根接种

2015年9月23日接种。在每株苗根系周围用滴管或注射针筒加10 mL孢子悬浮液（孢子悬浮液浓度约为12 000个·mL-1）。培养期间用无菌水浇水，保持基质湿润[5]。

1.4 菌根观察及照相

接种后不定期检测菌根发育状况。随机抽取苗木（图1A），将外生菌根用无菌的小镊子取下，在体视镜下用毛刷刷掉泥土，蒸馏水清洗干净，在体视显微镜（日本，OLYMPUS）和光学显微镜（日本NIKON80I）下观察菌根的形态和变化，记录其特征并照相。

1.5 菌根分子检测

黑孢块菌接种华山松无菌苗9个月后，从被接种树的须根取长近2 mm的菌根30个左右，在体视镜下用毛刷刷掉泥土清洗干净后，用改进的CTAB法提取菌根的 DNA，真菌通用引物 ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，ITS5：5’-GGAAG TAAAAGTCGTAACAAGG-3’，PCR扩增 ITS片段，25 μL 反应体系包括：2×PCRmix 12.5 μL，10 μmol·L-1的引物各 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件为：94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸7 min。扩增片段测序之后，序列在GeneBank进行Blast比对，以确定感染华山松形成菌根的真菌是否是黑孢块菌。

2 结果与分析

2.1 菌根特征

黑孢块菌与华山松形成的菌根形态见图1。

2015年9月23日接种，2015年11月5日（接种后第45天）抽取苗木和小根，在体视显微镜下观察，小根有明显根毛，未形成菌根。2016年4月27日（接种后7个月） 抽样调查，发现有大量菌根（图1D）。菌根呈黄褐色，单轴（图1F） 或者二叉分枝状（图1 D和图1 E)。单根菌根长0.3 mm～4 mm，直径为0.3 mm～0.6 mm。在显微镜下观察，自菌套（fungus mantle） 延伸出的外延菌丝（emanating hyphae） 近无色（图1E和图1F），有呈近直角状的分枝（图1G）；其菌根表面呈马赛克镶嵌结构。

2.2 菌根感染率检测

实验苗木接种9个月后进行检测[8]。培育200株苗木，随机抽取10株，每株苗的根在体式菌下观测是否形成菌根。观测结果显示10株苗中9株形成菌根，菌根生长发育良好，感染率为90%。

2.3 分子检测

测序峰图清晰，无重叠峰，说明仅有1种真菌与华山松形成菌根。ITS序列与黑孢块菌序列的同源性为100%，确定与华山松形成菌根的真菌为黑孢块菌。

3 讨论

黑孢块菌在自然条件下，主要生长在阔叶树下，栽培黑孢块菌也都用阔叶树做共生树种[2]。利用黑孢块菌孢子液接种华山松树苗，并成功合成了黑孢块菌的菌根苗，为法国黑孢块菌种质资源的本土化利用奠定了坚实的基础。从形态学方面看，华山松和黑孢块菌形成的菌根与印度块菌和华山松形成的菌根类似[9]，即外延菌丝呈近直角分枝，其菌根表面呈马赛克镶嵌结构[7]。进一步通过分子检测确认是黑孢块菌形成的菌根，排除了印度块菌形成的菌根的可能性，使我们的试验结果可信。分子检测十分必要和重要。

[1]刘波，陶恺.地下真菌研究简史及我国已知种[J].食用菌，1989，11 （1）：2.

[2]王云，刘培贵.块菌名实考证及其自然资源保护[J].植物分类与资源学报，2011，33（6）：625-642.

[3]弓明钦，陈羽，王凤珍.黑孢块菌的苗木菌根化合成效果研究[J].林业科学研究，2003，16（1）：52-57.

[4]胡宝元，刘启福.黑孢块菌与青刚栎形成外生菌根之多样性[J].台大实验林研究报告，2008，22（1）：55-60.

[5]胡弘道，苏开美，柴红梅.夏块菌与青刚栎形成外生菌根形态的研究[J].云南植物研究，2011，32（6）：489-494.

[6]胡弘道.块菌（松露） 之培育与食谱[M].台北：华香园出版社，2010.

[7]林强，冉晓潇，赵军，等.黑孢块菌、夏块菌菌根苗培育及菌根检测技术研究[J].四川林业科技，2013，34（1）：41-43.

[8]郭秀珍，毕国昌.林木菌根及应用技术 [M].北京：中国林业出版社，1989.

[9]Geng LJ,Wang XH,Yu FQ,et al.Mycorrhizal synthesis of Tuber indicum with two indigenous hosts,Castanea mollissima and Pinus armandii[J].Mycorrhiza,2009,19(7):461-467.

Study on Mycorrization of Pinus armandii with Tuber melanosporum

SU Kai-mei1,ZHANG Xiao-lei1,LI Fu-min2,LI E-xian1,LI Shu-hong1
(1.Biotechnology and Germplasm Resources Institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650223,China;2.Forestry Bureau of Luliang County,Luliang 655604,China)

Tuber melanosporum Vittad.is a mycorrizal mushroom with high economic value.In this paper,production of mycorrhizal seedings of Pinus armandii Franch.with T.melanosporum was studied.The results showed that T.melanosporum formed ectomycorrhizae on the root tips of P.armandii in seven months after inoculation.Ectomycorrhizae were yellowish-brown and became red-bown and atrophied afrer aging.The ectomycorrhizae was monopodial and binary branch with 0.3 mm-0.5 mm in diameter and 0.3 mm-4 mm in length,the surface was mosaic structure,and the emanating hyphae were transparent and translucent,with a branch of nearly right angle.The mosaic surface and emanating hyphae with right angle branching are very important morphological characters of the mycorrhizae formed by T.melanosporum and P.armandii.

Tuber melanosporum;Pinus armandii;microscopic structure;symbiotic fungi

S646.9

A

1003-8310（2017）05-0021-03

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.05.005

云南省环保厅（2016012）；国家现代农业产业技术体系（CARS20）。

苏开美（1965-），女，本科，正高级工程师，主要从事菌根食用菌研究。E-mail:kaimei@sina.com

**通信作者：李树红（1978-），男，硕士，副研究员，主要从事珍稀食用菌资源保护与利用研究。E-mail:shuhongfungi@126.com

2017-07-10