CRISPR基因魔剪助力HIV／AIDS治愈

李 云，周佳义，张锦鹏，姜东伯，杨 琨（第四军医大学：基础部免疫学教研室，学员旅，陕西西安7003）

CRISPR基因魔剪助力HIV／AIDS治愈

李 云1，2，周佳义1，2，张锦鹏1，2，姜东伯1，杨 琨1
（第四军医大学：1基础部免疫学教研室，2学员旅，陕西西安710032）

抗逆转录病毒疗法（ART）通过高效抑制艾滋（AIDS）患者体内Ⅰ型免疫缺陷病毒（HIV⁃1）的复制，获得了显著的临床效果，但由于潜伏在患者体内病毒库的存在，艾滋病仍然是不治之症．近年来，基因编辑技术发展迅速，以锌指核酸酶（ZFNs）技术、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）技术和sgRNA（single guide RNA）引导的CRISPR／Cas9技术最为引人注目．利用这些基因手术刀，可以从多个途径预防病毒对体内正常细胞的感染，抑制或阻止其在体内的复制，例如对能被病毒感染的CD4＋T细胞的两种辅受体CCR5和CXCR4基因进行突变，或者将整合到被感染的人体细胞中的前病毒DNA切除．其中CRISPR／Cas9技术以其强大的基因编辑和调控转录激活关闭的潜能，加之操作的易行和通用等特点，成为当前治疗艾滋病的最具前景的基因编辑技术．

ART；基因编辑技术；CRISPR／Cas9；人类免疫缺陷病毒

0 引言

Ⅰ型免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus type 1，HIV⁃1）感染仍是当前世界公共卫生的主要难题之一．针对该病毒的抗逆转录病毒疗法（anti⁃retrovirus therapy，ART）提出至今已有20年，有效控制了疾病的发展和蔓延．但是单一依靠该疗法不能完全清除患者体内潜伏的病毒库，患者停药将面临复发的危险，因此需要终生服药，同时承受精神和经济的双重压力．而现今，基因编辑技术迅速发展并日趋成熟，从ZFNs，TALENs到CRISPR／Cas9，经历三代技术变革，其中CRISPR／Cas9尤为突出，因其极强大的可操作性，成为当下最热门的基因编辑工具．因此运用基因编辑技术在分子水平上实现对HIV⁃1的治疗，是当前研究的一个热点．目前，已有研究者利用基因编辑技术实现了对HIV⁃1辅受体CCR5和CXCR4基因的突变，切除HIV⁃1整合到宿主细胞中的病毒基因片段，或利用失去剪切活性的dCas9激活或关闭HIV⁃1基因的转录．

1 三代基因编辑技术

1．1 锌指核酸酶技术锌指核酸酶（zinc⁃finger nucleases，ZFNs）由具有DNA识别功能的锌指蛋白（zinc⁃finger proteins，ZFP）和非特异性核酸内切酶（FokⅠ）构成，其中每个锌指蛋白识别一个特异的三联体碱基，将多个锌指蛋白串联起来可以识别一段特定的碱基序列．串联起来的锌指蛋白与执行剪切功能的FokⅠ结合后可致定位靶点产生DNA双链的断裂（double⁃strand breaks，DSBs），然后启动DNA损伤修复机制，产生插入或删除突变（Indels）．

Tebas等［1］选择了依靠抗逆转录病毒药物控制病情的12位艾滋病患者，收集他们的外周血在体外培养其T淋巴细胞，并用ZFN突变细胞中的CCR5基因，之后将经过修饰的细胞回输患者体内．其中6位患者暂停了抗逆转录病毒疗法，他们的HIV水平反弹比通常情况慢，表明这一尝试虽还不能永久性治疗HIV，但是可以在病程上起到缓解作用．

锌指核酸酶技术有广泛的应用性和发展潜力，但仍存在价格昂贵、耗时长、具有细胞毒性和一定的脱靶效应等限制．

1．2 转录激活因子样效应核酸酶技术转录激活因子样效应核酸酶（transcription activator⁃like effector nucleases，TALENs）由两个TALEN蛋白组成，每个TALEN蛋白包含一个非特异性的FokⅠ内切酶域和一个可定制的DNA结合域．两个TALEN蛋白分别靶定在DNA两条链的结合位点上，FokⅠ二聚体对中间的spacer区域进行切割，产生DSBs并启动DNA损伤修复机制．

对于HIV⁃1的感染，TALENs和ZFNs破坏CCR5基因的效力都能高达45%，但TALENs则引起更少的细胞毒性和脱靶效应［2－3］．在诱导多功能干细胞研究中，TALENs对CCR5Δ32单个等位基因的打靶效力可以达到100%，其中双等位基因打靶达到14%［4］．

在过去的4～5年里，TALENs由于其简单的设计，高度的切割效率，近于无限的打靶范围，已经被广泛应用于酵母、哺乳动物和植物中，但是TALENs仍存在脱靶效应，而且用慢病毒载体转运TALENs比较容易导致基因组的重排，因此在临床上的应用还需要更加优化的策略［5］．

1．3 RNA引导的CRISPR／Cas9技术CRISPR系统由 crRNA（CRISPR⁃derived RNA）和 tracrRNA（trans⁃activating RNA）碱基互补配对组成的tracrRNA／crRNA复合物与Cas9蛋白构成，tracrRNA／crRNA复合物引导Cas9蛋白在前间区序列邻近基序（protospacer⁃adjacent motif，PAM）上游处对 crRNA结合的特定DNA序列进行切割，产生DSBs并启动DNA损伤修复机制，其中PAM序列一般为NGG或NAG（N代表任意核苷酸）．而将两种RNA进行改造连接，设计成简化的sgRNA（single guide RNA）后，其与野生型RNA具有类似的活力，且更加方便实用．

与ZFNs和TALENs相似，Cas9技术也具备改造CCR5基因的能力．在诱导多功能干细胞（induced pluripotent stem cells，IPSCs）的研究中，用CRISPR／Cas9技术对CCR5Δ32转基因的双等位基因进行打靶，效率高达33%，优于TALENs的14%［4］．

CRISPR／Cas9系统因其价格低廉、操作简便、具有较高的打靶效率和较低的细胞毒性而得到广泛应用．但是由于Cas9蛋白序列较大，将其用腺相关病毒载体转运至人体内一直存在问题，近期的研究显示将该分子不同亚基分别导入，在体内组装成为完整的Cas9蛋白已被证明是有效的方法［6－7］．运用CRISPR突变HIV⁃1辅受体和破坏其病毒库是目前在基因水平上治疗HIV⁃1／AIDS的主要策略．

2 使用CRISPR／Cas9系统编辑CCR5和CXCR4基因

HIV⁃1进入人体细胞需要结合细胞表面的CD4受体和CCR5或CXCR4两种趋化因子辅受体中的至少一种．其中，CCR5是HIV⁃1进入细胞的主要辅受体．“柏林病人”在接受纯合CCR5Δ32突变捐献者的异源造血干细胞移植后，艾滋病得以完全治愈［8－9］．而之后运用该方法对其他患者进行的治疗尝试却不尽如人意［10－11］．有报告显示，在接受ART的患者中，46%同时感染CCR5和CXCR4分别依赖的两种HIV毒株，4%仅感染CXCR4依赖的毒株，单纯CCR5依赖型感染占大多数，但值得注意的是CCR5依赖型病毒可以进化为 CXCR4依赖型［12］．因此，利用CRISPR／Cas9技术在造血干／祖细胞（hematopoietic stem or progenitor cells，HSPCs）或IPSCs中将两种受体基因同时突变，或许是一种HIV完全治愈的可行方案．

免疫系统中的巨噬细胞，树突状细胞和记忆T细胞中均有CCR5基因的表达，该受体在炎症应答中具有将细胞引导至炎症区域并增强适应性免疫应答的作用［13］．CCR5Δ32突变可以保护相应的人群免于AIDS等疾病的困扰，但也会在病原感染后的炎症反应中产生一些不利影响［14］，如CCR5Δ32突变将使机体对黄病毒的免疫力较正常人群低［15］．但总体上，不同研究发现，CCR5Δ32基因突变群体可能已经存在了700～2250年［16］，并分布广泛［13］，可见CCR5功能缺失并没有对个体产生严重的不利影响．

CXCR4是SDF⁃1（CXCL12）的特异性α⁃趋化因子受体，参与淋巴细胞的趋化．SDF⁃1在造血干细胞中有重要作用，与CXCR4之间的信号接触可调节B细胞CD20的表达［17］．另外，研究证明，泛素也是CXCR4的配体，其抗炎作用通过CXCR4介导的信号通路实现［18］．当然，CXCR4的其它功能也不能忽视，在正常小肠黏膜中的CD4＋T淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、小胶质细胞、NK细胞等都有CXCR4的表达［19］，可见CXCR4缺陷的HSPCs或IPSCs分化建立的免疫系统将是不健全的．因此全身系统性地突变CXCR4会对人体产生不利影响，而部分改造可以作为折中策略：在体外利用CRISPR／Cas9将患者HSPCs或IPSCs中的CCR5和CXCR4基因定点突变，并诱导其分化为T细胞和单核细胞的祖细胞（如祖T细胞和祖单核细胞），将其回输入患者体内后，其中祖T细胞通过淋巴细胞归巢，能够增殖并分化为免疫系统所需的CD4＋T细胞，祖单核细胞则增殖分化为单核／巨噬细胞．而CD4⁃的其他细胞亚群依然由没有经过突变的HSPCs分化而来，CCR5和CXCR4基因依然保留为野生型，因此重构的免疫系统中CCR5和CXCR4功能基本正常．此外，CXCR4的功能抑或能在其他通路得到补偿，如SDF⁃1也可以靶定CXCR7受体发挥作用［20］．

Ye等［4］在野生型 IPSCs中，体外用 CRISPR／Cas9技术对CCR5Δ32的双等位基因进行打靶，效率高达33%，之后他们将这些修饰过的IPSCs分化成单核／巨噬细胞，并验证了它们对HIV⁃1感染的抵抗性．Kang等［21］用单靶向型sgRNA引导的CPISPR／Cas9编辑IPSCs的CCR5基因，结果发现：12．5%的细胞内CCR5被编辑，其中有22．2%是双等位基因．而使用双靶向的sgRNAs则有效地提高编辑CCR5的效率至27%，双等位基因被编辑的效率占其中的41%．鉴于Cas9编码序列较大，有研究者首次使用腺病毒载体来运载CRISPR／Cas9组合物，能够有效地感染原代CD4＋T淋巴细胞，并破坏其CCR5基因的表达［22］．

另有研究者用慢病毒包装的CRISPR／Cas9工具系统将CXCR4功能进行缺失突变，再分别导入到Ghost⁃CXCR4细胞、Jurkat细胞和原代人类CD4＋T细胞中，实现感染细胞中CXCR4双等位基因的失活，从而使细胞对 HIV⁃1的感染产生抵抗［12］．然而，在CD4＋T细胞中，使用一般的CRISPR／Cas9技术仅能失活1%～5%目标蛋白质的表达．Schumann等［23］将sgRNA与Cas9蛋白结合成Cas9核糖核蛋白（Cas9 RNPs），并在体外用电穿孔法将其导入人类CD4＋T细胞中，可致高达40%的细胞失去CXCR4的高水平表达．

干细胞拥有自我更新并分化成多种多样特化细胞的能力．自体移植经过基因修饰的HSPCs或IPSCs能够提供针对HIV⁃1的一种功能性治疗方案．目前对于IPSCs，可以有效维持其体外特定的分化状态，而在HSPCs中导入CRISPR／Cas9系统后，其分化状态如何还有待进一步研究．另外CRISPR系统对两种细胞是否具有特异性也需要进行对比，才能进一步确定使用哪种细胞更加行之有效．通过电穿孔法将CRISPR／Cas9系统体外导入相关靶细胞是一种有效的方法，若需使用病毒载体进行体内转染，由于慢病毒载体可能导致基因的重排，腺病毒载体有较强的免疫原性，而腺相关病毒（adenovirus associated virus，AAV）载体已被批准使用，并且SaCas9的编码序列较小，所以可将SaCas9与AAV进行组合，或许是可行的．

3 使用CRISPR／Cas9系统破坏HIV⁃1病毒库

HIV可以将自身基因整合到患者体细胞的基因组中，这些细胞被称为HIV病毒储存库，它们产生极低水平的病毒蛋白，因此可以同时避免细胞病理效应和宿主免疫清除．中断ART或给予病毒库刺激，能激活储存库而表达病毒相关蛋白从而大量扩增病毒，使HIV不能彻底治愈．利用 CRISPR／Cas9技术针对HIV⁃1病毒库进行治疗的方法包括：①实现对整合到宿主细胞中的前病毒基因的切除；②限制病毒复制；③将病毒储存库细胞唤醒后杀死．

3．1 运用CRISPR切除HIV⁃1基因组Hu等［24］运用Cas9／sgRNA在体外有效地编辑了HIV⁃1 LTR U3区域的高度特异性靶位，并在潜伏被感染的小胶质细胞，单核／巨噬细胞和T细胞中成功阻止了病毒基因的复制和表达．Cas9／sgRNAs对宿主细胞既没有产生基因毒性也没有产生脱靶编辑，并完全切除了整合前病毒DNA的从LTRs 5’端到3’端的一处9709⁃bp片段．另外，当病毒基因整合到宿主基因组的不同区域时，在被感染的细胞中使用多种sgRNA能够将多处病毒基因组切除．

Zhu等［25］测试了在HIV⁃1 DNA中能被CRISPR／Cas9打靶的10个位点，测序结果显示，靶定Rev第二个外显子靶位（被称为T10）的CRISPR／Cas9，能够有效突变HIV⁃1 DNA中的所有靶位，显示出较高的突变水平．

另外有研究者发现，在体外导入靶向于HIV⁃1的CRISPR／Cas9系统后，人类IPSC细胞仍能有效分化为可以被HIV⁃1感染的细胞类型，如单核／巨噬细胞，说明该CRISPR／Cas9系统没有明显的细胞毒性，并且分化后的细胞也被证实能够获得对HIV⁃1感染的抵抗性［26］．

运用该方法对HIV⁃1患者自身骨髓造血干细胞进行基因改造后回输入体内或许是行之有效的临床治疗方案．在这项策略中使用有剪切活性的Cas9蛋白容易对与靶向基因同源或相似的序列进行切割，产生脱靶效应，甚至细胞毒性，因此在临床治疗中选择恰当的 sgRNA极为重要．上述研究中所选用的sgRNA及其Cas9蛋白对细胞没有产生明显的毒性，可以提供参考．

3．2 运用CRISPR限制HIV⁃1基因复制虽然哺乳动物的限制因子能限制HIV⁃1和其他病毒的复制，但它们通常在相关靶向细胞中不表达．因此，通过使用合成的转录因子诱导限制因子表达可能是抑制病毒复制的一种潜在途径．通过失活Cas9的催化活性位点得到没有剪切活性的dCas9，它可以募集转录激活结构域到特定的启动子区域来激活转录，表达限制因子．而且最近Konermann等［27］用可以选择性结合MS2噬菌体外壳蛋白的两个极小的发卡结构取代sgRNA的两个末端颈环结构，利用这一机制使sgRNA招募多个转录激活结构域，从而增强转录的效力．

Bogerd等［28］使用构建的SAM（synergistic activa⁃tion mediators）诱导了两种限制因子 APOBEC3G（A3G）和APOBEC3B（A3B）的表达．当他们使用单个sgRNA时，只观察到A3G和A3B中等程度的表达激活，当使用两种sgRNA时，二者则呈现高水平表达．尽管A3G或A3B蛋白都能阻断Vif缺陷型HIV⁃1的复制，但由于A3G会被HIV⁃1的Vif蛋白降解，所以只有A3B蛋白能够抑制野生型HIV⁃1．这些研究表明，利用sgRNA／Cas9招募转录激活因子这种方法，可以对影响病毒复制的内源性基因进行筛选．由于目前没有有效的办法将构建的转录因子系统有效递送至已被感染的潜伏T细胞，而且限制因子不一定能完全抑制病毒的复制和转录，因此它在临床上的应用还有待观望．

3．3 运用CRISPR激活病毒库细胞并将其清除通过再激活休眠的病毒，在ART和免疫清除的作用下，清除潜伏的病毒库，这种策略被称之为“唤醒并杀死（shock and kill）”［29］．

Saayman等［30］通过将dCas9和VP64转录激活结构域整合在一起，利用构建成的 dCas9⁃VP64／sgRNAs系统靶向激活HIV⁃1前病毒LTR区的启动子，并在病毒基因的增强子中发现“hotspot”区域，通过靶向此区域，能够在被感染的T细胞中高度有效增强病毒基因的转录活化．

Limsirichai等［31］证明dCas9和潜伏期反转化合物（latency⁃reversing compounds）的组合能够促进潜伏HIV⁃1的转录，并且使用以CRISPR为基础的乙酰转移酶的基因表观修饰也能促进病毒基因激活．他们评估了 dCas9⁃VP64和 SAM（synergistic activation mediator）系统引导基因激活的能力，并发现后者激活转录的水平要比前者高．而且当SAM结合潜伏反转复合物如组蛋白去乙酰酶抑制剂和酪氨酸激酶抑制剂时，能协同增加潜伏HIV的激活．另外，使用以CRISPR／Cas9为基础的乙酰转移酶（dCas9⁃p300）进行基因表观修饰能显著再激活潜伏的HIV．同时，有研究者利用dCas9⁃SAM系统在HIV⁃1潜伏的TZM⁃bI上皮细胞、Jurkat T细胞和CHME5小胶质细胞中激活HIV⁃1前病毒基因表达，并发现在后两者的细胞中由于病毒蛋白毒性的积累，导致了细胞的自杀［32］．

由于在HIV患者体内T细胞被大量杀伤，依赖机体自身免疫系统清除被重新激活的潜伏病毒库细胞并不现实．而通过病毒蛋白积累导致的细胞自杀或者结合抗逆转录病毒疗法，或许是在临床上应用该方法的正确途径．但是由于目前很难在体外建成可以代表体内潜伏病毒库的细胞模型［30］，加上向潜伏细胞中传递基因的效率较低［32］等，运用CRISPR并联合ART在临床上应用这种“shock and kill”策略还存在许多限制．

4 结语

纵观几十年艾滋病的临床治疗，依靠单一的临床干预难以将其彻底治愈已是不争的现实．CRISPR／Cas9技术因其在经济效益和操作便捷等方面明显的优势而受到广泛关注，从该方法提出至今区区三年时间，已在基因水平治疗艾滋病方面提供了多条思路，显示出良好的应用前景．通过有剪切活性的Cas9蛋白可以实现对HIV⁃1感染人体细胞相关辅受体的编辑从而阻止感染，并对整合到宿主细胞中的前病毒基因进行切除，而失去剪切活性的dCas9可以引导病毒储存库细胞前病毒的激活，再结合抗逆转录病毒疗法将其消灭，还可以引导宿主细胞限制因子的表达，从而抑制病毒基因的复制．综上所述，类似于现有的鸡尾酒疗法，可与CRISPR／Cas9引领的基因编辑策略进行组合，从而形成彻底治愈HIV⁃1的一套方案．然而，Cas9对PAM序列的依赖性使其不能靶向任意基因，sgRNA与DNA的不完全匹配以及目标基因与其它基因的同源性对脱靶率也存在影响，这些在一定程度上限制了Cas9的广泛使用．近期国人在基因编辑技术方面的研究取得了突出成绩，韩春雨等［33］报道的结合单链guide DNA（gDNA）的核酸内切酶NgAgo（Natronobacterium gregoryi Argonaute）没有PAM序列的限制，并且gDNA与靶向DNA之间互补配对的容错率较低，应用于HIV⁃1的基因治疗，在理论上能够减少细胞毒性，并且能够任意靶向病毒库细胞中HIV⁃1基因并实现剪切，虽然该技术目前受到了质疑，但是仍然有团队利用其实现了基因的表达敲降［34］．另外南京大学周国华教授的团队报道了结构引导的核酸内切酶技术，并证明其有删除大片段DNA的潜力［35－36］，因此在切除整合在宿主细胞中的HIV⁃1基因时，可以保证HIV⁃1基因的功能完全丧失．基因编辑技术迅猛发展，在助力HIV／AIDS的治愈上将发挥更加强大的作用，希望在不久的将来可以实现在临床上对HIV⁃1的彻底治愈．

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Magic scissors CRISPR and HIV／AIDS cure pursue

LI Yun1，2，ZHOU Jia⁃Yi1，2，ZHANG Jin⁃Peng1，2，JIANG Dong⁃Bo1，YANG Kun1
The Fourth Military Medical University：1Teaching and research office of Immunology， Based Department；2Student brigade，Xi’an 710032，China

anti⁃retrovirus therapy has achieved obvious clinical efficiency by suppressing the replication of HIV⁃1 in the patients with acquired immunodeficiency syndrome， AIDS．However，AIDS still remains incurable because of latent virus reservoirs in patients infected．In recent years，with the rapid development of genome editing technologies，the ZFNs（zinc⁃finger nucleases）and TALENs（transcription activator⁃like effector nucleases）and CRISPR／Cas9 guided by single guide RNA have been utilized to edit the gene of HIV⁃1 co⁃receptors，such as CCR5 and CXCR4 in CD4＋T cells，or to excise the provirus genes which integrate into the genome of somatic cells infected，aiming to prevent the normal cells from HIV⁃1 or to restrict the replication of the virus in human body．At present，CRISPR／Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats／CRISPR⁃associated nuclease 9） has been shedding new light on HIV⁃1 cure pursuing，due to its pow⁃erful potential in genomic editing and transcription regulation in common with feasible manipulation．

ART；genome editing technologies；CRISPR／Cas9；human immunodeficiency virus

R512．91

A

2095⁃6894（2017）02⁃60⁃05

2016－11－18；接受日期：2016－12－05

国家自然科学基金面上项目（81171977）

李 云．E⁃mail：387783851＠qq．com

杨 琨．教授．E⁃mail：yangkunkun＠fmmu．edu．cn姜东伯．E⁃mail：superjames1991＠foxmail．com