紫铆因通过自噬途径促进骨肉瘤细胞凋亡及机制研究

蔡宁宇 潘天龙 李斌 吴登颖 潘骏

紫铆因通过自噬途径促进骨肉瘤细胞凋亡及机制研究

蔡宁宇 潘天龙 李斌 吴登颖 潘骏

目的研究紫铆因对骨肉瘤细胞凋亡及自噬的影响，并探讨自噬在紫铆因抗骨肉瘤中的作用。方法分别以不同浓度紫铆因作用骨肉瘤细胞24h和30μmol/L紫铆因作用骨肉瘤细胞不同时间，使用CCK-8试剂盒测定细胞活性变化；Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3及自噬相关蛋白p62、LC3、Beclin-1的表达情况；TUNEL染色检测骨肉瘤细胞的凋亡情况；透射电子显微镜检测自噬泡的产生；最后分别用自噬激动剂和自噬抑制剂预处理后再加入紫铆因作用于骨肉瘤细胞，并重复上述实验。结果紫铆因作用后，骨肉瘤细胞的活性明显下降，Bax、Cleaved caspase3、Beclin-1、LC3 II的表达增加，而Bcl-2、p62的表达降低，骨肉瘤细胞出现明显的凋亡现象，透射电子显微镜观察到紫铆因处理组有较多自噬泡产生；使用自噬抑制剂预处理骨肉瘤细胞后，紫铆因对骨肉瘤的凋亡效果被逆转，而使用自噬激动剂预处理骨肉瘤细胞后，紫铆因使骨肉瘤细胞凋亡的效果进一步增强。结论紫铆因可以降低骨肉瘤细胞活性并促进其凋亡；同时紫铆因可以激活自噬，促进骨肉瘤细胞凋亡。

紫铆因骨肉瘤凋亡自噬

骨肉瘤的发病率在骨骼恶性肿瘤中居首位，其恶性程度高，易发生肺转移，进展迅速。1982年，Rosen提出新辅助化疗的概念，使阿霉素、顺铂、甲氨蝶呤等药物[1-2]广泛应用于骨肉瘤治疗，患者的5年生存率显著提高[3-4]。然而骨肉瘤拥有易复发、易转移的特性，患者的长期生存率并没有进一步提高[5]。近年来，天然药物以来源丰富、安全范围广、提炼成本低等优势成为肿瘤治疗领域的热点。紫铆因是来源广泛的多酚类化合物，化学名2′, 3,4,4′-四羟基查尔酮（2′,3,4,4′-Tetrahydroxychalcone），具有抗肿瘤、抗血管生成、抗氧化等多种生物学活性，已在多种肿瘤细胞中（如乳腺癌[6-7]、肝癌[8-9]、肺癌[10]及黑色素瘤[11]等）展现出抗肿瘤特性，但其对骨肉瘤细胞的作用并未被明确阐明。自噬是溶酶体对受损细胞器及无功能蛋白进行消化的过程[12]，适量激活自噬可以增强肿瘤细胞应对外界刺激的能力[13]，过度激活自噬则会导致肿瘤细胞死亡，因此了解自噬激活所起的作用对肿瘤的治疗至关重要。本研究探讨紫铆因对骨肉瘤细胞的抗肿瘤作用，进一步检测其对肿瘤细胞自噬的激活作用并探讨自噬的作用。

1 材料和方法

1.1 细胞和试剂骨肉瘤MG63细胞株购于中科院生命科学研究院细胞库。紫铆因、雷帕霉素（Rapamycin, Rapa）、6-氨基-3-甲基嘌呤（3-Methyladenine,3MA）均购于美国Sigma公司；胎牛血清、DMEM基本培养基购于美国Gibco公司；CCK-8试剂盒、BCA试剂盒购于中国碧云天公司；TUNEL试剂盒购于瑞士Roche公司；Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3、p62、LC3、Beclin-1抗体均购于美国CST公司；β-actin抗体、山羊抗兔抗体、山羊抗鼠抗体均购于美国Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养骨肉瘤MG63细胞使用含10%胎牛血清，1%青、链霉素双抗的DMEM培养基培养于37℃、含5%CO2培养箱中。