组织蛋白酶S的研究进展

王林燕 王博 戴灵豪 杜仲燕 关旸 丁美红

组织蛋白酶S的研究进展

王林燕 王博 戴灵豪 杜仲燕 关旸 丁美红

组织蛋白酶S（Cat S）是半胱氨酸蛋白酶的重要一员，主要分布在淋巴结、脾脏、肺等器官，多在表达主要组织相容性复合物Ⅱ的细胞中表达，在抗原递呈中发挥重要作用，参与疾病的发生、发展过程。Cat S还与炎症因子相互作用，参与体内免疫及炎症反应，在心血管、免疫系统和肿瘤等疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。本文通过概述CatS的结构、与疾病的关系、上下游通路、活性检测方法及抑制剂等方面内容，为今后开展CatS的研究提供部分参考。

组织蛋白酶S 上下游通路 活性检测 抑制剂

组织蛋白酶（Cat）是在动物组织的细胞内（特别是溶酶体部分）发现的一类蛋白酶，它通过水解肽链降解蛋白质以维持细胞内环境稳定。它具有抗原递呈、细胞信号转导、激活受体、促进趋化因子或细胞因子释放等功能。Cat结构最早在20世纪Drenth等在番木瓜中发现，现已发现人体内共有15种Cat，根据水解机制不同可分为丝氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸蛋白酶；根据底物特异性，又可分为肽链内切酶和肽链内外切酶。Cat是由无活性的前体酶原水解而成，先在核糖体结合膜上合成前体酶原，后在高尔基体通过糖基化及磷酸化作用形成甘露糖-6-磷酸蛋白，最后通过溶酶体上甘露糖-6-磷酸特异性受体的识别作用，间接转运到溶酶体中。Cat S是半胱氨酸蛋白酶家族的一员，具有重要的调节功能，人体Cat S最早由Shi从肺泡巨噬细胞中提取。不同于其他半胱氨酸蛋白酶，Cat S最佳活性pH值为4～6，在中性条件下可保持酶活性；主要分布在淋巴结、脾脏、肺等器官，多在表达主要组织相容性复合物Ⅱ（MHCⅡ）的细胞中表达，在抗原递呈中发挥重要作用，参与疾病发展过程[1]。此外，Cat S还与炎症因子相互作用，参与体内免疫及炎症反应，在心血管、免疫系统和肿瘤等疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。本文就CatS的研究进展作一综述。

1 CatS结构

Cat S具有木瓜蛋白酶家族相似的晶体结构，为单链蛋白，含225个氨基酸，相对分子质量为24.8KDa，与其他半胱氨酸蛋白酶结构在氨基酸序列上存在同源性。三维空间结构由2个结构域组成：（1）L结构域，由3个α螺旋和一个疏水口袋组成；（2）R结构域，由含有1个疏水核嵌入的反平行β折叠和位于侧面的2个α螺旋组成[2]。2个结构域之间构成狭长裂隙，为催化活性部位。结构中的半胱氨酸25、组氨酸159和天门冬酰胺175构成催化三联子，是结合底物的重要部位。Cys25中硫阴离子作为亲和物质是催化反应的关键部位，能够进攻底物肽。Cat S的N端有3个凹槽（即S1、S2和S3）与底物的特异性结合相关，决定了半胱氨酸蛋白酶抑制剂的特异性。C端存在一个与底物结合的位点，即S1'，在酶与主要组织相容性复合体二类分子保守区的特异性结合中起着重要作用。

2 Cat S与疾病的关系

Cat S可降解细胞内外正常蛋白质，在体内炎症免疫、抗原递呈、血管生成、细胞增殖、细胞外基质重塑、损伤、修复等病理、生理过程中发挥着重要的调节功能，与多种临床疾病的发生、发展和转归息息相关。

2.1 自身免疫性疾病 1999年研究表明Cat S与自身免疫性疾病密切相关，Cat S缺陷小鼠对胶原诱导的关节炎易感性较低[3]。Cat S在类风湿关节炎患者的血清和膝关节液中的表达水平明显升高[11]，巨噬细胞大量表达Cat S并分泌进入软骨组织，可能会破坏功能性软骨聚集蛋白聚糖-二型胶原网状组织的完整性，在炎症性滑膜细胞中发挥抗原递呈、基质降解的双重作用。Cat S抑制剂和F类风湿关节炎ctalkine（趋化因子CX3C亚家族的唯一成员）抗体可减轻类风湿关节炎大鼠的机械性超敏反应和脊髓小胶质细胞反应，可作为治疗类风湿关节炎疼痛的潜在药物[5]。此外，Cat S对系统性红斑狼疮也有影响，可驱动MHCⅡ介导的T细胞和B细胞活化并形成生发中心，促使B细胞向浆细胞转化，从而促进疾病发生、发展，而Cat S抑制剂可通过特异性阻断自身抗原递呈而改善疾病[6]。

2.2 慢性气道炎症性疾病 相关研究表明，卵蛋白引起的小鼠肺损伤模型与正常小鼠比较，其Cat S基因表达量明显增加[7]。高氧诱导的肺损伤，经Cat S基因敲除处理，动物肺泡功能明显改善，并可减少巨噬细胞流入和肺部纤维性病变。采用ELISA检测健康者与哮喘患者血清中Cat S含量并绘制24h昼夜变化曲线，发现哮喘患者Cat S含量明显高于健康者，但是24h期间哮喘患者与健康者Cat S含量基本不随时间变化或变化不明显[8]。此外，有研究发现Cat S-/-与野生型哮喘大鼠比较，其气道高反应性、IgE水平均较低，肺部炎症明显减弱[9]。亦有关于Cat S启动子区域的单核苷酸多态性与哮喘发病率的关系研究，发现启动子上rs7534124和rs1136774单核苷酸多态性可降低汉族人群哮喘易感性[10]。

2.3 心血管疾病 心血管疾病严重威胁人类健康，一般与动脉粥样硬化相关。动脉粥样硬化的形成原因主要是血管的细胞外基质重塑、弹性蛋白的降解。当血管平滑肌细胞受IL-1β和IFN-γ刺激时，会分泌Cat S并降解不溶性弹性蛋白，从而影响动脉粥样斑块稳定性。在血管紧张素Ⅱ的刺激下，心血管部位巨噬细胞的Cat S mRNA表达量增多，巨噬细胞介导的溶胶原和弹性蛋白酶活性明显增加，通过血管紧张素受体拮抗剂（奥美沙坦）可抑制Cat S的活性，增强Apoe-/-小鼠动脉粥样斑块的稳定性[11]。此外，有研究表明Cat S抑制剂RO544－4101可降低慢性肾脏疾病Apoe-/-小鼠动脉粥样硬化发病率，降低巨噬细胞中生长分化因子-15、单核细胞趋化蛋白-1含量[12]。Cat S还与腹主动脉瘤、静脉移植排斥反应、急性心肌梗死患者心力衰竭相关。与Apoe-/-Cat S+/+比较，Apoe-/-Cat S-/-小鼠的腹主动脉瘤发病率显明显降低[13]。而且人体血液中总Cat S和活性Cat S的含量与BMI、舒张压和主动脉直径呈正相关，与最低踝肱指数呈负相关[14]。

2.4 肿瘤 Cat S可诱导肝细胞癌细胞凋亡并增加化学敏感性。血管生成是肿瘤发生的关键标志，抑制血管生成是抗肿瘤的新策略。Cat S如同血管内皮生长因子一样，在血管生成中起着重要作用，在肿瘤微环境中促进细胞外基质的水解与内皮细胞的侵袭，从而诱发血管生成，促使肿瘤的发生、发展。协同使用Cat S抑制剂与抗血管内皮生长因子能起到有效抑制血管生成的作用。Cat S也可介导自噬通量和自噬体、溶酶体的融合，激活自噬激发巨噬细胞M2型极化，诱使肿瘤发生[15]。Cat S与癌症转移亦密切相关，它是乳腺-脑转移的调节剂，依靠水解黏附蛋白并通过血脑屏障迁移。

2.5 其他疾病 Cat S是蛋白酶活化受体2的偏向激动剂，可引起PAR2和瞬时感受器电位离子通道家族香草素受体亚家族依赖性炎症和疼痛[16]，注射Cat S抑制剂可抗神经性大鼠过敏性疼痛和异常性疼痛。Cat S过表达可使小鼠骨骼肌营养不良，当Cat S基因敲除时，mdx小鼠肌纤维肌膜稳定性明显增强[17]。在溶酶体运输和自噬过程中，Cat S与Rab11家庭相互作用使蛋白4表达上调，而下调Cat S可影响巨噬细胞的自噬过程[18]。此外，Cat S还可引起小鼠受体依赖性瘙痒。

3 Cat S上下游通路研究

IFN-γ通过激活Janus激酶/信号转导子与转录激活子通路启动细胞转录功能，上调不同细胞中Cat S的表达量；也可增加小鼠肥大细胞及骨髓源性肥大细胞Cat S的mRNA和蛋白水平，并具有一定的时间剂量依赖关系[19]。miR-31/IRF-1/Cat S通路可能在囊性纤维化肺部疾病的发病中发挥作用，通过miR-31模拟物降低干扰素调节因子1、Cat S的表达和分泌[20]。

Cat S通过激活NF-κB和caspase-3诱导肝细胞癌细胞凋亡并增加其化学敏感性；也可激活CD74，调控趋化因子CCL2的表达，从而对肿瘤微环境产生影响[21]。Cat S可促进表皮生长因子介导的表皮生长因子受体降解，调节表皮生长因子受体信号；而Cat S抑制剂可抑制表皮生长因子受体降解，促使表皮生长因子受体信号延长，促使下游信号转导和转录激活子3、蛋白激酶B信号激活[22]。CatS是Mas相关的G蛋白偶联受体（Mrgprs）的配体，可激活MrgprC11，从而引起瘙痒。Cat S也是PAR2的偏向激动剂，通过切割PAR2的氨基末端，暴露一个新拴系配体KVDGTS，激活PAR2并产生PAR2的特异性下游信号，刺激第二信使激活，引起PAR2依赖性炎症和疼痛，使PAR2作为蛋白酶驱动的炎性疼痛放大[23]。

4 Cat S活性检测

学者们常采用Western blot、ELISA等方法测定酶表达量及含量的变化，但是酶的关键参数除含量外，活性也是重要指标。Cat S以前体酶原形式存在时无活性，不发挥生理功能，因此对酶的活性进行精准测定具有重要意义。Cat S活性检测方法主要有底物检测、探针检测。底物检测通过测定底物浓度或含量的变化反应酶的活性，是经典方法；探针检测是目前Cat S活性检测最常用的方法，可分为底物探针检测和活性探针检测。

4.1 底物探针检测 底物探针检测是将Cat的底物肽与荧光染料键和作为Cat的底物，Cat与底物结合并水解肽链，释放出荧光基团，采用特定的荧光检测方法测定荧光强度，以荧光强度高低反应Cat的活性。目前已有许多底物探针如Z-FR-AMC，Z-Val-Val-Arg-AMC等用于测定Cat S活性。以Z-Phe-Arg-AMC为底物，同时结合分子对接技术研究化合物的Cat S的抑制作用。以Z-VVR-AMC为底物，探究蛋白酶抑制剂对树突状细胞中Cat S活性的调节作用。底物探针检测原理是Cat水解肽链，释放出荧光染料，测定荧光强度，此过程中酶的结合是可逆的，酶的活性依然保存。但底物探针检测专一性差，易出现假阳性，与Cat S同源性高的其他酶也能水解底物肽，释放荧光染料；底物肽穿透性差，只可用于检测细胞裂解液，无法直接检测组织或细胞内的Cat S活性。但是，不断有学者对底物探针检测进行优化探索，使底物检测的特异性升高，如Steimle等[24]开发的底物Mca-GRWPPMGLPWE-Lys（Dnp）-DArg-NH2在pH7.5时可特异性结合Cat S，提高检测的特异性、准确性并且节约实验时间。

4.2 活性探针检测 活性探针由3个部分组成：可与Cat连接的弹头部位；增强对1种或多种酶特异性识别的识别元件；可用于检测的标记物。3个部分元件功能各不相同，相辅相成，共同实现蛋白酶活性的实时体内成像和高通量活性筛选。近年来有学者对Cat S的活性探针研究发现，以放射性元素碘标记的探针可用于体内外检测Cat S活性[25]。将Cat S底物与棕榈酸酯化，可实现探针探头目标定位的长久性和高信噪比；通过小鼠尾静脉注射，用于体内成像，以实现肿瘤的非侵入性鉴定[26]。将多种原理的探针相结合，如基于近红外淬火的探针结合绿色荧光反应的探针用于Cat S活性的测定，可实现不同种类探针的互补，为活性蛋白定位[27]。ZPraVG-DMK探针，修饰后的肽基重氮甲基酮可渗透入细胞，测定细胞内Cat S活性[28]。以人cystatin C抑制位点的N-端底物样区域作为支架，连接到重氮甲基酮作为探针，更易与半胱氨酸蛋白酶B、L、S和K结合，且灵敏度高，可在nM范围内检测Cat活性[29]。

活性探针通过共价键与Cat不可逆性结合，使Cat失去活性；与底物探针检测比较，活性探针可穿透细胞，不仅能检测细胞裂解液，实现活细胞体内定位，同时其检测特异度和灵敏度均较高。

5 Cat S抑制剂研究

Cat S与多种疾病相关，被认为是类风湿性关节炎、哮喘、肿瘤等疾病的生物治疗靶点，因此抑制剂研究是Cat S领域研究的热点。Cat S抑制剂通过与Cat S的Cys25位点结合，发挥抑制作用，但Cat S同源性较高，对其他Cat可能也会产生抑制作用[30]。因此，研究并开发特异性的Cat S抑制剂是研究的难点。

5.1 化学合成抑制剂 Cat S抑制剂主要有芳氨乙基酰胺类化合物、丁二酸酰胺类化合物、二肽类化合物、非肽类抑制剂等。Battu等[31]基于药物的三维定量构效关系和分子对接技术研究Cat S的抑制剂，发现新Cat S抑制剂的多个前导分子。Wilkinson等[32]对含氰基Cat S抑制剂进行体内外抗肿瘤药效学评价，结果表明其具有极大的应用价值和开发潜力。另有研究发现，当化合物不与Cat S的Cys25位点结合，仅与S2和S3位点特异性结合，对Cat S的活性也有抑制作用，同时对其他半胱氨酸Cat活性无影响，如LY3000328化合物，具有Cat S的特异性抑制作用[33]。

5.2 Cat S天然抑制剂 关于Cat S天然抑制剂的研究很少。刘毅夫等[34]研究发现中药淫羊藿中的淫羊藿苷、淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷、宝藿苷Ⅰ、淫羊藿苷A、箭藿苷B、朝藿定B和大花淫羊藿苷C单体对Cat S的活性有抑制作用。此外，Zhang等[35]研究发现蜂毒素可通过调控VEGF-A/ VEGFR2/MEK1/ERK1/2信号通路抑制Cat S介导的肿瘤生长和血管形成，可能是Cat S的抑制剂。

6 小结

近年来，Cat S因其广泛的生理功能在国外掀起了研究的热潮，学者们对Cat S的生物学功能和对疾病的影响开展了深入研究；而关于Cat S影响疾病的机制及其上下游通路的研究尚在探索之中。Cat S对疾病的发生、发展具有重要作用，众多学者以Cat S作为疾病治疗靶点，期望寻找有效的Cat S抑制剂，治疗各类疾病。但半胱氨酸蛋白酶的同源性较高，许多抑制剂的特异性低，对其他半胱氨酸蛋白酶亦有抑制作用。因此，寻找一种特异性高、不良反应小的Cat S抑制剂是研究的难点。天然药物是药物研发的巨大宝库，建议充分发挥天然药物的优势，在天然药物中挖掘Cat S抑制剂。Cat S活性检测是研究Cat S的重要手段，主要有活性探针检测和底物探针检测，两者各有优势与不足，应根据具体实验需求选择合适的检测方法，建议Cat S活性检测与Cat S蛋白含量检测等检测方法整合，共同阐明科学问题。

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2017-01-23）

（本文编辑：陈丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.6.2017-46

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王林燕，E-mail：linyan0520@126.com