多糖纯化工艺的研究

杜佳

实验方法

葡聚糖凝胶柱层析。（1）sephadexG-200预处理。称取一定量的Sephadex G-200干粉，用去离子水浸泡24h，充分溶胀后装入层析柱中，用 0.1mol/L 的 NaCl 溶液平衡12h；（2）Sephadex G-200 柱层析法。将经DEAE-52纤维素柱层析法分离出的多糖组分，流速条件在 1mL/min下进行洗脱，每管收集2mL。用苯酚硫酸法逐个检测每管收集的多糖溶液，标以收集多糖溶液的收集编号作为横坐，吸光值作为纵坐标绘制洗脱曲线。

蛋白质去除率的单因素实验。（1）反应温度对蛋白质去除率的影响。准确称取10ml多糖溶液，加入浓度为4%的三氯乙酸溶液，分别在20、40、60、80、100℃温度下，控制静止时间在30min，取上清液测定蛋白质含量，计算不同处理温度下所对应的蛋白质去除率；（2）反应时间对蛋白质去除率的影响。准确称取10ml粗多糖溶液，在80℃的水浴锅中处理样品，加入浓度为4%的三氯乙酸溶液，反应时间分别控制在10min、20min、30min、40min、50min，静止，取上清液测定蛋白质含量，计算不同静止时间下所对应的蛋白质去除率；（3）三氯乙酸用量对蛋白质去除率的影响。准确称取10ml粗多糖溶液，在80℃的水浴锅中处理，静止时间控制在30min，三氯乙酸的用量分别控制在1%、3%、5%、7%、9%，取上清液测定蛋白质含量，计算不同三氯乙酸用量下所对应的蛋白质去除率。

实验结果与分析

蛋白质标准曲线的确定。根据蛋白标准曲线蛋白含量含量在20-100mg范围内线性关系良好，相关系数R2=0.9903，回归方程y =1.725x + 0.0039。

多糖纯化。（1）香菇多糖经 Sephadex G-200柱层析结果分析。用纤维素柱层析分析可知，用蒸馏水洗脱出的多糖溶液，在490nm处出现了两个吸峰A和B，其中A峰所占的面积比较大，所以主要成分应该是A峰处的多糖。将收集到的A和B的样品进行冷冻干燥，待使用；（2）香菇多糖经 Sephadex G-200 柱层析结果。称取冷冻干燥后的A、B干粉各100mg，溶于10mL水中，吸取 5mL混合样液于柱中，用蒸馏水作为洗脱液，在流速条件为0.5 mL/min下进行洗脱，每管分别收集5mL，然后用苯酚硫酸法进行检测，重复试验3次，取平均值，制作洗脱曲线。

对所得结果进行分析，在第8管收集的的洗脱液已经可以检测到 A，并且从8-28管逐渐增加，从8至28管A的含量急剧增大，第28管到达最大值，然后又逐渐减小。到48管以后基本检测不出A的存在了。A洗脱出的曲线是一对称峰，由此确定A为单一的物质。同样，B洗出的曲线也呈单一曲线峰，所以也可证明B是单一组分；（3）紫外光谱扫描结果。对 A、B两种组分在190到400nm波段进行紫外光谱扫描，经过分析可知，在211nm处有吸收峰，但在260、280nm处均无吸收峰，由此可以证明在A、B中不含有核酸和蛋白质。

结论

通过Sephadex G-200柱层析对 A和B两种多糖组分进行洗脱，得到的洗脱曲线均呈单一对称峰，说明A和B都是单一的多糖组分。通过对组分进行紫外光谱扫描，通过紫外光谱扫描的结果可知，两个多糖组分中均不含核酸和蛋白质。其中，反应条件为：三氯乙酸用量为5%，反应时间为50min，反应温度为80℃。在此工艺条件下，多糖损失率只有26.7%，而蛋白去除率率可以达到61.8%。