石英粉尘对小鼠气道结构及黏蛋白Muc5b表达的影响*

邹晓雪， 周 婷△， 李 妍， 李周洲， 付国庆， 刘跃伟， 叶方立， 张志兵，3

1武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉 4300652湖北省疾病预防控制中心应用毒理湖北省重点实验室，武汉 4300793美国弗吉尼亚联邦大学妇产科学系，里士满 23298



石英粉尘对小鼠气道结构及黏蛋白Muc5b表达的影响*

邹晓雪1， 周 婷1△， 李 妍1， 李周洲1， 付国庆1， 刘跃伟2， 叶方立1， 张志兵1，3

1武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉 430065
2湖北省疾病预防控制中心应用毒理湖北省重点实验室，武汉 4300793美国弗吉尼亚联邦大学妇产科学系，里士满 23298

目的 探讨石英粉尘对小鼠肺组织内气道结构及黏蛋白Muc5b表达的影响。方法 将54只雄性C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、生理盐水组、石英染尘组，每组18只。空白对照组不作任何处理，生理盐水组和石英染尘组分别给予一次性气管灌注50 μL无菌生理盐水和50 mg/mL石英粉尘悬液，于灌注后第1、7、28天每组分别处死6只。取小鼠右肺中叶置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，进行苏木精-伊红、AB-PAS和Masson染色，观察小鼠肺组织内支气管结构的改变，采用免疫组织化学法分析肺组织内黏蛋白Muc5b的表达。结果 在各个时间点，空白对照组和生理盐水组小鼠肺组织内支气管结构正常，表面分布有极少量黏蛋白；石英染尘组在灌注后第1天小鼠肺组织内支气管结构基本正常，周围炎性细胞浸润，分泌少量黏蛋白；灌注后第7天肺组织内支气管壁增厚，管腔变窄，肺泡间隔增厚，内有大量炎性细胞浸润，黏蛋白分泌量较多；灌注后第28天小鼠支气管壁、肺泡间隔明显增厚，部分支气管完整性被破坏，周围可见少量胶原沉积，偶见小块状纤维化，黏蛋白分泌量增多。石英染尘组小鼠肺组织内黏蛋白Muc5b主要定位于支气管黏膜层表面及肺泡间隔，其表达水平随染毒时间的延长而逐渐升高，且均高于同期空白对照组和生理盐水组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论 石英粉尘可导致小鼠肺组织内支气管壁增厚，管腔变窄，炎性反应明显，出现不同程度的纤维化改变，黏蛋白Muc5b表达量显著增加。

石英粉尘； 气道结构； 黏蛋白； Muc5b

石英粉尘，俗称矽尘，其主要成分是游离SiO2，不仅广泛存在于矿山开采、金属冶炼、机械制造及建筑等行业的工作场所空气中，而且还可通过工业排放、沙尘暴及火山爆发等多种方式逸散到生活环境中。流行病学研究结果表明，虽然长期吸入含石英的粉尘可导致以肺组织纤维化为主的矽肺，但即使肺组织未出现矽肺的影像学特征，患者的肺功能也呈现不同程度的下降，出现慢性支气管炎、肺气肿及慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等多种以通气功能障碍为主的呼吸系统疾病[1-6]。肺功能的下降会极大影响工人的劳动能力及生活质量，给劳动者的家庭带来严重的疾病负担和经济压力，但目前对石英致肺功能下降的机制尚不十分清楚。正常的呼吸道结构及气道表面的黏液纤毛系统作为呼吸系统最重要的第一道防线，是维持肺组织正常通气功能的重要因素，其中黏液层中黏蛋白Muc5b又是影响黏液纤毛清除功能的核心组分[7-9]。因此，本研究选择单次暴露式气管灌注石英粉尘的染毒方法，探讨石英粉尘对小鼠呼吸道结构及黏蛋白Muc5b表达的影响，分析其在石英导致的以气道通气功能障碍为主的肺部疾病中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

超声波清洗仪(华南超声设备厂)，光学显微镜(日本Olympus公司)。Muc5b单克隆抗体(美国Abcam公司)，PAS染色试剂盒(珠海贝索生物)，Masson染色试剂盒(珠海贝索生物)，即用型免疫组化超敏SP试剂盒(迈新生物)。

1.2 石英粉尘来源及悬液制备

本研究使用的中国标准石英粉尘由中国疾病预防控制中心职业卫生与毒物控制所提供。化学组分：游离SiO2含量>97%；粉尘粒径分布：<1 μm 57%，1～ μm 34%，2～ μm 4.5%，3～ μm 3.0%，4～5 μm，1.5%。

称取一定量的石英粉尘，高压灭菌后用无菌生理盐水配制成50 mg/mL的粉尘悬浮液，于染尘前超声15 min使粉尘充分混匀。

1.3 动物分组与染毒

SPF级C57BL/6健康雄性小鼠54只，体重(17±1)g，由湖北省疾病预防控制中心提供，动物合格证号为SCXK(鄂)2015-0018，于湖北中医药大学实验动物中心饲养。饲养条件：温度20～24℃，湿度50%～60%，照明昼夜交替12 h/12 h，正常进食与清洁饮水。将小鼠随机分为空白对照组、生理盐水组、石英染尘组，每组18只。采用单次暴露式气管灌注法，生理盐水组和石英染尘组分别给予50 μL无菌生理盐水和50 mg/mL石英粉尘悬液，空白对照组不作任何处理。

1.4 肺组织的采集

各组小鼠分别于染毒后第1天、第7天和第28天进行腹腔麻醉，眼球后静脉丛放血处死，取出肺组织后，用4℃生理盐水浸洗2次，将右肺中叶置于4%多聚甲醛固定液中固定和保存。

1.5 病理组织形态学检查

将已固定的肺组织进行石蜡包埋，5 μm切片，采用苏木精-伊红(HE)及Masson染色观察肺组织炎性反应及纤维化的程度，采用阿尔辛蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色观察气道黏液分泌的情况，中性黏液物呈红色，酸性黏液物呈蓝色，混合性黏液物呈紫红色，于光学显微镜下观察并拍照。

各组肺组织纤维化结果根据Ashcroft 等[10]的方法分为4级：正常肺组织，计分为0；轻度纤维化，支气管壁或肺泡壁有轻度纤维性增厚，但不伴有肺泡结构的明显破坏，计分为1；中度纤维化，支气管壁或肺泡壁中度纤维性增厚，同时伴有肺泡结构损伤，并有小的纤维条带或者纤维块生成，计分为2；重度纤维化，伴有肺泡结构严重损伤，并且形成大块纤维化，造成肺实变，计分为3。

1.6 免疫组织化学法检测黏蛋白Muc5b

将制备好的石蜡切片置于60℃烘箱中烘烤1 h，经二甲苯及不同浓度梯度的乙醇脱蜡复水，蒸馏水冲洗，95℃抗原修复30 min，37℃烘箱中血清封闭30 min；加Muc5b一抗(1∶200)4℃过夜，PBS冲洗3遍；加二抗37℃孵育30 min，PBS冲洗3遍；滴加生物素标记的链霉素抗生物素蛋白，37℃孵育20 min，PBS冲洗3遍，DAB显色，苏木精复染，清水洗净、脱水、封片。在光学显微镜下观察黏蛋白Muc5b的表达并拍照，使用Image-Pro Plus 6.0软件进行图像分析，以平均吸光度值(A)作为检测结果，进行定量分析。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠肺组织炎性反应

由图1可见，在各个时间点，空白对照组和生理盐水组小鼠肺组织内支气管结构正常，均未见炎性细胞浸润。石英染尘组小鼠在灌注后第1天肺组织内支气管、肺泡间隔及肺泡结构尚清晰，支气管壁及周围有大量炎性细胞浸润，部分肺泡壁和肺泡间隔增厚，内可见大量中性粒细胞和巨噬细胞浸润；灌注后第7天，小鼠肺组织内支气管壁增厚，少部分脱落至气道腔内，管腔变窄，肺泡壁及肺泡间隔也增厚，内有大量炎性细胞浸润，部分肺泡腔内可见少量浆液性渗出物；灌注后第28天，小鼠肺组织结构破坏严重，部分支气管的完整性被破坏，肺组织内支气管壁、细支气管壁、肺泡壁及肺泡间隔明显增厚，肺泡腔内聚集大量巨噬细胞、中心粒细胞及淋巴细胞等炎性细胞，部分融合形成细胞性结节。

图1 各组小鼠肺组织内支气管炎性反应(苏木精-伊红染色，×400)Fig.1 Inflammatory changes of bronchioles in lung tissue of blank control group，saline group and silica dust group (HE staining，×400)

2.2 小鼠肺组织的纤维化改变

从图2可以看出，在各个时间点，空白对照组和生理盐水组小鼠肺组织结构清晰完整，支气管壁及肺泡壁均未见纤维化改变。石英染尘组小鼠在灌注后第1天，肺组织内支气管壁及肺泡壁均未见纤维性增厚；灌注后第7天偶见小鼠肺内支气管壁周围有少量胶原纤维沉积；灌注后第28天小鼠支气管及肺泡结构被破坏，支气管壁周围、肺泡间隔内可见胶原沉积，出现小块状纤维化改变。我们对各组肺纤维化结果进行分级评分发现：石英染尘组小鼠在灌注后第1、7、28天肺组织纤维化评分分别为(0.04±0.05)、(1.53±0.06)、(2.31±0.06)分；与空白对照组(0分)相比，石英染尘组小鼠在灌注后第7、28天肺组织纤维化评分明显增高(均P<0.01)；且随着染毒时间的延长，肺纤维化的程度逐渐加重，各检测时间点比较差异均有统计学意义(均P<0.01)。

2.3 小鼠肺组织内黏液分泌

肺组织AB-PAS染色结果(图3)可见，在各个时间点，空白对照组及生理盐水组小鼠肺组织内有极少量紫红色的黏蛋白阳染颗粒。石英染尘组小鼠在灌注后第1天，肺组织内支气管周围及增厚的肺泡间隔内有明显的紫红色PAS阳性颗粒；灌注后第7天肺组织的炎性区域及支气管黏膜层有较多紫红色黏蛋白阳染颗粒；灌注后第28天肺组织内增厚的支气管及肺泡间隔区域有较多紫红色黏蛋白阳染颗粒。

2.4 小鼠肺组织中黏蛋白Muc5b的表达

由图4可见，黏蛋白Muc5b棕黄色阳染颗粒主要定位于肺组织的支气管壁黏膜层表面、肺泡壁及肺泡间隔中。在各个时间点，空白对照组和生理盐水组，肺组织支气管黏膜层及肺泡间隔可见极少量棕黄色颗粒。石英染尘组小鼠在灌注后第1天，肺组织支气管壁及肺泡间隔内有较明显的棕黄色颗粒，灌注后第7、28天，支气管壁黏膜层表面、肺泡间隔及肺泡壁分布的棕黄色颗粒均明显增多。

我们对各组棕黄色颗粒进行半定量分析发现，与同期空白对照组和生理盐水组相比，在各个染毒时间石英染尘组小鼠肺组织内黏蛋白Muc5b表达量明显增多，差异有统计学意义(均P<0.01)；石英染尘组小鼠在灌注后第7、28天肺组织内的Muc5b表达量明显高于灌注后第1天，差异有统计学意义(均P<0.01)，而第28天和第7天之间差异无统计学意义(P>0.05)，具体结果如表1所示。

组别染毒时间第1天第7天第28天空白对照组0.90±0.071.11±0.121.07±0.11生理盐水组1.07±0.141.26±0.131.10±0.09石英染尘组3.35±1.29*#5.92±0.99*#△8.27±1.01*#△

与空白对照组比较，*P<0.01；与生理盐水组比较，#P<0.01；与同组第1天比较，△P<0.01

3 讨论

本研究通过单次暴露式气管灌注石英粉尘的方法，探讨石英粉尘对小鼠肺组织内气道结构的影响，结果发现小鼠肺组织在石英粉尘暴露第1天即开始出现大量炎性细胞浸润，肺内支气管及肺泡间隔均有大量黏液分泌，黏蛋白Muc5b的表达量增加，并随染毒时间的延长呈逐渐上升趋势；灌注后第7天小鼠肺内开始出现支气管管壁增厚，管腔变窄，支气管周围可见少量胶原沉积；至第28天小鼠肺组织内支气管及肺泡结构被破坏，支气管壁周围、肺泡间隔甚至出现小块状纤维化改变。

近来有研究发现，肺组织中小气道的纤维化，是导致气道出现阻塞性通气功能障碍的重要因素[11-12]。本研究也发现石英粉尘可引起小鼠肺组织内支气管壁及肺间隔明显增厚，管腔变窄，部分支气管结构出现断裂，管壁周围可见少量胶原沉积甚至小块纤维化改变，与郭嘉丽等[13]研究结果一致。提示石英粉尘暴露早期致肺组织内支气管炎性反应及纤维化的修复过程可能是引起以通气功能障碍为主的呼吸系统疾病发生的基础。

正常气道黏膜表面覆盖有少量的黏液，主要由气道上皮杯状细胞及黏膜下腺体合成分泌的黏蛋白和气道上皮细胞分泌的水及电解质组成，对清除呼吸道异物、维持气道微环境及通气功能具有重要的作用[14]。但另一方面，慢性黏液高分泌是COPD的重要病理改变，在无腺体小气道形成的“黏液栓”可致气道阻塞，肺功能严重下降，是导致COPD患者死亡的潜在危险因素[15-17]。临床病理检查结果显示，COPD患者的无软骨气道表面“黏液栓”所占的比例(mucus-occupying ratio，MOR)达到20%，远高于正常人群的比例(<1%)[18]。本研究结果发现，自小鼠气管内灌注石英粉尘后第1天开始，支气管壁及肺泡壁内均出现较多紫红色的黏蛋白阳性颗粒，随着染毒时间的延长，黏蛋白的分泌量也增加，提示石英粉尘进入机体后短时间内即可引起肺组织内气道黏液分泌亢进，黏蛋白表达量增加。早期研究结果显示矽性蛋白沉着症患者的肺泡腔内也充满了PAS阳染的黏蛋白颗粒[19]，我们的研究结果与之一致。因此，肺组织内黏液分泌量增加可能是石英致通气功能障碍性疾病发生的早期改变。

现有研究表明，黏蛋白(mucin，Muc)是呼吸道黏膜表面黏液层的重要组分，其中Muc5b是黏膜下黏液腺细胞分泌的主要黏蛋白，正常情况下主要表达在主支气管[7-9]，从主支气管到细支气管Muc5b的表达量逐渐减少，至终末细支气管及肺泡壁细胞基本无Muc5b的表达[20]，其对维持呼吸系统黏液纤毛清除功能及肺组织自身免疫平衡具有决定性的作用[21-22]。Roy等[21]通过动物实验证明Muc5b基因缺失小鼠气道黏液纤毛清除功能明显降低，上呼吸道通气功能障碍，但下呼吸道通气功能正常；然而Muc5b过表达转基因小鼠肺组织内巨噬细胞活性增强，IL-23表达量显著增加，明显增强了肺部的炎性反应。人群研究结果显示，慢性支气管炎、哮喘及COPD患者气道内腺体分泌的黏蛋白Muc5b明显增加[23-24]，与健康人群相比，重度哮喘患者黏液腺管及气道腔内存在大量的黏蛋白Muc5b形成的“黏液栓”[9，25]。过量Muc5b会形成丝条或团块状结构，改变了黏液流动的动力学特征，降低纤毛的协调摆动能力，阻碍黏液纤毛转运功能[26]。另有学者发现，COPD患者痰液中Muc5b/Muc5ac的比值显著升高，且与肺功能指标中的第1秒用力呼气容积呈负相关[23，27]。本次研究结果显示，石英染尘组小鼠肺组织内支气管表面及肺泡间隔内Muc5b的表达量明显增加，并随着染毒时间的延长呈逐渐升高的趋势，说明黏蛋白Muc5b表达异常可能是石英粉尘引起肺部炎性反应及引发气道通气功能障碍的关键因素。

综上所述，石英粉尘可导致小鼠肺组织内出现小气道管壁增厚，管腔变窄，炎性反应明显，出现不同程度的纤维化改变，黏蛋白Muc5b表达量显著增加。黏蛋白Muc5b的过表达可能是石英致呼吸道黏液分泌异常及炎性反应的主要诱因，对调控石英引发以通气功能障碍为主的呼吸系统疾病具有重要的作用，但同时Muc5b缺失又会导致肺组织抗感染能力下降，增加死亡的概率[21]。因此，我们后期可进一步探讨不同程度地阻断Muc5b对改善通气功能及控制黏液分泌的作用，为分析黏蛋白Muc5b在石英致气道损伤中的保护作用提供依据。

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(2016-08-20 收稿)

Influence of Silica Dust on Airway Structure and Expression of Muc5b in Mice

Zou Xiaoxue，Zhou Ting△，Li Yanetal

SchoolofPublicHealth，MedicalCollege，WuhanUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430065，China

Objective To explore the influence of silica dust on small airway structure and expression of Muc5b in lung tissue of mice.Methods Fifty-four male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups：blank control group，saline group and silica dust group.The blank control group had no treatment，whereas the saline group and silica dust group were treated with 50 μL volume of sterile saline and 50 mg/mL silica dust suspension by single intratracheal instillation，respectively.Six mice were sacrificed in each group 1，7 and 28 days after the treatments.The middle lobe of right lungs was fixed in 4% paraformaldehyde and dyed by HE，AB-PAS and Masson staining after paraffin embedding procedure.The changes of bronchial structure in lung tissue were observed under microscope.Then the expression of Muc5b in lung tissue was analyzed by immunohistochemistry.Results At each time point，the bronchial structure of lung tissue in mice was normal，the surface of the bronchial structure was covered with very few mucins in blank control group and saline group.In silica dust exposure mice，the bronchioles of lung tissue were infiltrated with inflammatory cells and covered with a small number of mucins on the surface 1 day after treatment.It was observed that thickened bronchial walls and alveolar septum，narrowed lumens，infiltration of a large number of inflammatory cells and secreted mucins were presented in lung tissue of mice 7 days after silica dust exposure.The bronchial walls and alveolar septum were obviously thickened，integrity of some bronchi was broken，deposited slight collagen even small pieces of fibrosis could be observed and mucins were increased in the lung tissue 28 days after silica dust exposure.In addition，the mucin of Muc5b was mainly located in mucous membrane layer of bronchi and alveolar septum.The expression of Muc5b gradually increased with the prolonged time of silica dust exposure，and it was significantly higher than that in blank control group and saline group at the same time point(P<0.01).Conclusion Silica dust can not only result in thickened bronchial walls，narrowed lumen，marked inflammatory responses and varying degrees of fibrosis，but also significantly increase the expression of Muc5b in lung tissue of mice.

silica dust； airway structure； mucin； Muc5b

*国家自然科学基金资助项目(No.81402659)；湖北省自然科学基金资助项目(No.2014CFB811)

R135.21

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.009

邹晓雪，女，1991年生，硕士研究生，E-mail：437992506@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：skyting1219@126.com