缺血性脑卒中患者的IL-18表达水平及其基因105A/C多态性与肺炎衣原体感染的相关性研究

童 伟， 张 超， 赵 文， 熊 琴， 褚天运， 杜凯丽



缺血性脑卒中患者的IL-18表达水平及其基因105A/C多态性与肺炎衣原体感染的相关性研究

童 伟， 张 超， 赵 文， 熊 琴， 褚天运， 杜凯丽

目的 探讨缺血性脑卒中患者体内IL-18表达水平的变化及其基因105A/C多态性与缺血性脑卒中疾病的相关性。方法 选择55例缺血性脑卒中患者为实验组，55例健康体检人群为对照组，收集全血标本后用ELISA检测试剂盒分别测定标本的血浆中CpnIgA、CpnIgG抗体水平及IL-18表达水平。应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对IL-18基因105位点进行基因分型。结果 AIS组CpnIgA阳性率明显高于健康对照组(χ2=18.18，P<0.05),而CpnIgG阳性率二者无显著性差异。AIS组的IL-18表达水平明显高于健康对照组，且CpnIgA阳性的AIS患者的IL-18表达水平高于CpnIgA阴性患者，但其基因105A/C基因多态性比较无统计学意义。结论 缺血性脑卒中的发生、发展与肺炎衣原体慢性感染和IL-18水平有关，和IL-18的105A/C基因多态性无明显相关，但具体作用机制还有待进一步研究。

缺血性脑卒中； 肺炎衣原体； IL-18； 基因多态性

缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS )又称脑梗死,中医称之为卒中。本病系由各种原因所致的局部脑组织区域血液供应障碍，导致脑组织缺血缺氧性病变坏死，进而产生临床上对应的神经功能缺失表现，严重危害人类的生命健康[1，2]。近年来大量流行病学调查研究提示肺炎衣原体感染与缺血性脑卒中密切相关[3～5]。白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)是一种重要的的促炎症细胞因子，属于白介素-1家族。大量研究显示IL-18的水平与冠心病、系统性红斑狼疮等相关[6,7]。但有关IL-18及其基因105A/C多态性与缺血性脑卒中关联性的研究报道较少。因此，本研究旨在探讨缺血性脑卒中患者IL-18表达水平及其基因105A/C多态性与肺炎衣原体感染的相关性，为缺血性脑卒中疾病的预防和诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 一般资料 缺血性脑卒中组55例,其中男29例，女26例,年龄为51～76岁,均来自湖北省襄阳市第一人民医院神经内科和康复科的住院患者，其诊断标准按照中华医学会神经病学分会脑血管病学组于发布的《中国缺血性脑血管病血管内介入诊疗指南》。对照组为健康体检人员55例,其中男28例,女27例，年龄为50～72岁。所有个体均签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 标本的采集及处理 55例缺血性脑卒中患者在入院次日早上采静脉血,健康对照组就诊当日取静脉血。静脉血标本均用EDTA-K2抗凝管收集3 ml。混匀，离心(3000 r/min)10 min，分离血浆,-80 ℃保存，供检测血浆肺炎衣原体抗体及IL-18，血液有形成分提取DNA ,供IL-18基因105位点检测。

1.2.2 标本测试 (1)肺炎衣原体IgA及IgG检测:Cpn抗体水平测定：严格按照 ELISA试剂盒操作说明(EUROIMMUN，德国)，半定量试验，r=测定吸光度/标准吸光度，r≥1.1为阳性，抗体的定量通过标准曲线直方图获取。(2)血浆中IL-18含量测定:按照IL-18 ELISA试剂盒说明书进行操作，制作标准曲线，酶标仪测定吸光度，然后计算IL-18含量。(3)IL-18基因105A/C多态性检测:采用酚氯仿法提取DNA，利用PCR-RFLP对IL-18基因105位点进行基因分型，105位点上游引物为5’-GTTATTGTAGAAAACCTGGAATT-3’，下游引物为5’-CCTCTAGTCAGAATCAGT-3’。IL-18基因105位点的PCR扩增条件95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环34次，末次循环后，72℃延伸5 min。PCR产物用TaqI进行酶切分型，酶切产物在3%琼脂糖凝胶上电泳，通过凝胶成像系统判断结果。AA基因型仅有148 bp一条条带，AC基因型有148 bp、123 bp、25 bp三条条带，CC基因型有123 bp、25 bp两条条带(见图1)。25 bp片段在琼脂糖凝胶电泳后条带跑出胶外故图1中无法观察到。

2 结 果

2.1 临床资料分析 缺血性脑卒中组和健康对照组在年龄和性别构成差异无统计学意义，本研究共缺血性脑卒中纳入病例55例，其中男性29例，女性26例，年龄为(62.6±10.8)岁；健康对照组55例，其中男性28例，女性27例，年龄为(61.3±9.2)岁。两组年龄分布差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 肺炎衣原体抗体IgA及IgG检测 55例缺血性脑血管病组血浆肺炎衣原体IgA阳性明显高于健康对照组，用χ2检验结果P<0.05,有统计学意义(见表1);二者肺炎衣原体抗体IgG比较无统计学意义(见表2)。

2.3 两组人员的血浆IL-18含量比较 缺血性脑卒中患者血浆IL-18含量明显高于健康对照组(见表3)。

2.4 肺炎衣原体抗体IgA阳性与阴性缺血性脑卒中患者血浆的IL-18水平 23例肺炎衣原体抗体IgA阳性缺血性脑卒中患者血浆IL-18含量的平均值为(295.5±58.3)ng/L，明显高于血浆肺炎衣原体抗体IgA阴性缺血性脑卒中患者(P<0.05，见表4 )，表明肺炎衣原体感染会影响IL-18的表达水平。

2.5 缺血性脑卒中组和对照组IL-18基因编码区105位点多态性比较 PCR-RFLP电泳图谱(见图1)，IL-18基因编码区105位点在对照组和缺血性脑卒中患者的基因型分布符合Hardy-Weinbger平(P>0.05，见表5),两组基因型分布频率达到遗传平衡,具有群体代表性。非条件Logistic回归参数估计显示IL-18基因105A/C基因多态性比较无统计学意义(P>0.05，见表6)，即IL-18的105A/C基因多态性与缺血性脑卒中无明显相关。

表1 两组样本肺炎衣原体感染lgA测定结果比较

缺血性脑卒中组与健康对照组相比P<0.01

表2 两组样本肺炎衣原体感染lgG测定结果比较

缺血性脑卒中组与健康对照组相比P>0.05

组别IL⁃18水平(ng/L)P值缺血性脑卒中组健康对照组247．8±56．4∗118．3±42．5<0．05

缺血性脑卒中组与健康对照组相比*P<0.05

表4 缺血性脑卒中组Cpn IgA阳性与阴性患者血浆的

与CpnIgA阴性组相比*P<0.05

表5 IL-18基因105位点等位基因频率的分析及构成比(%)

表6 非条件Logistic回归参数估计IL- 1 8基因105A/C单倍体基因型频率与缺血性脑卒中相关性分析

1为AC基因型;2、4、5为A A基因型;3为CC基因型

3 讨 论

缺血性脑卒中是脑血管病中的一种，流行病学资料显示，缺血性脑卒中患者逐年上升，且其发病人群逐渐年轻化，在存活的患者中，约有70%～80%脑血管病患者有不同程度的神经功能障碍，严重者失去生活自理能力，给社会和家庭带来了很大的负担[8]。缺血性脑卒中发病机制复杂，且治疗措施和效果都十分有限，因此积极探索其危险因素，有效地预防脑血管病的发生显得尤为重要。

通过本研究显示，缺血性脑卒中组的血浆肺炎衣原体抗体IgA阳性率明显高于健康对照组，而二者的肺炎衣原体抗体I gG比较无显著差异，IgG通常作为再次感染的标志物，IgA通常被认为慢性、持续感染的血清标志物，表明肺炎衣原体的慢性感染与缺血性脑卒中的发生发展有关，肺炎衣原体感染

是缺血性脑卒中的危险因素之一。那肺炎衣原体感染又是如何引起缺血性脑卒中的呢？研究表明白细胞介素18(interleukin，IL-18)具有诱导细胞产生多种细胞因子和增强Th1细胞活性等多种生物学的功能，在自身免疫性疾病，慢性炎症性疾病及慢性感染性疾病中充当着重要的角色[9,10]。因此我们检测了IL-18表达水平，结果显示,缺血性脑卒中组的IL-18表达水平明显高于对照组，然后我们再次比较了肺炎衣原体抗体IgA阳性与阴性缺血性脑卒中组血浆的IL-18水平，结果显示CpnIgA阳性的缺血性脑卒中患者血浆的IL-18水平高于阴性患者，说明肺炎衣原体感染影响脑卒中患者血浆IL-18的表达水平。综上表明，肺炎衣原体的慢性感染导致IL-18表达升高，从而诱发非特异性的炎症反应，进而引起脑血管的病变并促进了缺血性脑卒中的发生发展。然后我们又从基因水平研究了IL-18基因105A/C多态性与缺血性脑卒中的相关性，结果显示IL-18基因105A/C多态性与缺血性脑卒中无明显相关。

通过本课题的研究有利于为缺血性脑卒中疾病的预防和诊治提供提供新的思路，然而其具体作用机制还需更深入的研究。

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Correlation analysis of the infection of chlamydia pneumoniae and the expression levels of interleukin-18 and its gene 105A/C polymorphisms in acute ischemic stroke

TONGWei,ZHANGChao,ZHAOWen,etal.

(TheAffiliatedXiangyangNo.1People’sHospitalofHubeiUniversityofMedicine，Xiangyang441000，China)

Objective To explore the correlation of the infection of Chlamydia pneumoniae and the expression levels of interleukin-18 and its gene Polymorphisms in acute ischemic stroke (AIS) patients.Methods Detect the level of interleukin-18 and Chlamydia pneumoniae antibody CpnlgA and CpnIgG by ELISA in the plasma of the healthy control and AIS patients,then investgate interleukin-18 Gene 105A/C Polymorphisms by the method of restriction fragment length polymorphism (RFLP-PCR).Results The positivity of CpnlgA in patients with AIS was higher than that in healthy control (χ2=18.18).There was no difference in IgG positivity.The level of Interleukin-18 in the acute ischemic stroke patients was higher than that in healthy controls,and which in the AIS patients with CpnlgA positivity was higher than that with CpnlgA negative.There was no significant difference in the interleukin-18 Gene 105A/C Polymorphisms.Conclusion The chronic infection of Chlamydia pneumoniae and the expression levels of Interleukin-18 was related to AIS and might involve in the trigger and development of AIS,but there was no significant correlation between IL-18 gene105A/C polymorphism with AIS.

Acute ischemic stroke； Chlamydia pneumoniae； Interleukin-18； Gene polymorphisms

1003-2754(2016)12-1095-03

2016-08-04；

2016-11-30 基金项目：湖北省襄阳市科技局项目[襄科计(2014)-11号] 作者单位：(湖北医药学院附属襄阳第一人民医院检验科，湖北 襄阳 441000) 通讯作者：童 伟，E-mail：tw888@sohu.com

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