长链非编码RNA DANCR在关节软骨损伤修复中作用机制的研究进展

张 聘，杨 超，赵建宁，张 雷［南京医科大学金陵临床医学院（解放军南京总医院）骨科，南京大学医学院临床学院（解放军南京总医院）骨科，解放军南京总医院骨科，江苏南京000］

·综述·

长链非编码RNA DANCR在关节软骨损伤修复中作用机制的研究进展

张 聘1，杨 超2，赵建宁3，张 雷3［1南京医科大学金陵临床医学院（解放军南京总医院）骨科，2南京大学医学院临床学院（解放军南京总医院）骨科，3解放军南京总医院骨科，江苏南京210002］

长链非编码RNA（lncRNA）是一类转录本长度超过200个核苷酸但缺乏蛋白质编码功能的RNA，在许多细胞生物过程中发挥重要的调控作用．关节软骨损伤修复一直是关节外科的热点与难点．最近研究表明lncRNA DANCR在间充质干细胞（MSCs）向软骨细胞分化和增殖过程中发挥重要作用．lncRNA DANCR可能通过断裂为miRNA、结合或竞争mR⁃NA／miRNA、增加胞质内β⁃catenin等途径发挥促软骨损伤修复作用．本文就lncRNA DANCR的结构、功能及在关节软骨损伤修复过程中的可能作用机制作一综述．

DANCR；miRNA；间充质干细胞；软骨修复

0 引言

关节软骨在膝关节传导分布运动载荷、维持和承受接触应力方面起着重要的生理作用．由于关节软骨缺乏神经分布和血管供应的自身特点，一旦损伤，其自我修复往往有限［1－2］．正因为关节软骨具有重要的生理功能和独特的营养供应模式，关节软骨损伤修复一直是关节外科的研究热点．长链非编码RNA（Long non⁃coding RNA，lncRNA）是一类转录本长度大于200 nt，由基因组中非编码序列转录生成的，不具有翻译成蛋白质能力的RNA．既往被认为是基因组中的“暗物质”［3］．但近年来，大量实验证明部分lncRNA在表观遗传水平、转录水平、翻译水平、蛋白修饰过程中均可发挥重要的调控作用．目前已发现多种lncRNA在软骨分化增殖中出现异常表达［4］，其中lncRNADANCR（differentiationantagonizing non⁃protein coding RNA）在调控间充质干细胞向软骨分化过程发挥重要作用．

1 软骨损伤修复的策略

临床上根据国际软骨修复协会（International Cartilage Repair Society，ICRS）分级法对关节软骨损伤进行分级．学者和临床医师普遍认为关节软骨损伤的修复程度与损伤类型有关，直径1．0～2．0 mm的损伤常产生外观与正常透明软骨相似的修复组织；直径3 mm以上的损伤又称关节软骨缺损（articular cartilage defects，ACD），大多不能完全修复，而由纤维软骨填充；而当ACD直径＞6 mm，其不但不能修复，还会进一步损伤周围骨壁以及周围关节软骨，形成更大的缺损空洞，进而引起损伤周围的软骨下滑和关节软骨的塌陷，造成膝关节骨关节炎．因此研究ACD的治疗，对于阻断膝关节损伤→ACD→骨关节炎这一疾病模式等具有重要意义．

目前主要的治疗方案是减轻疼痛和控制炎症改善功能．非甾体类抗炎药（nonsteroidal anti⁃inflamma⁃tory drugs，NSAIDs）、糖皮质激素注射多年来广泛应用，但目前的治疗策略对于关节组织退行性变没有影响［6］．不同的手术方法也已被尝试修复受损软骨、改善关节功能，如微骨折、软骨下钻孔和关节成形术．这些技术的目的是促进内在的愈合、促进血管的侵入、纤维蛋白凝块的形成和招募干细胞［7］．然而，微骨折组织生物力学特性较差以及并发症，细胞少与周围软骨损伤限制了它们的使用，此外，长期疗效尚不清楚．当药物和手术管理策略失败，疾病进展到终末期关节炎，关节置换术可能成为唯一的和不可避免的选择．

干细胞治疗有望成为替代关节置换治疗骨关节炎的突破点．间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）主要来源于骨髓、滑膜、脂肪组织、牙髓等，具有自我更新能力，并能分化为软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、心肌细胞、肝细胞、神经元．它们是骨和软骨组织工程中的细胞来源［8－9］，其中滑膜间充质干细胞（synovial⁃derived MSCs，SMSCs）相比于其他来源的间充质干细胞（如骨髓、脂肪等），SMSCs的成软骨能力和组织分化能力更强，目前已成为最理想的软骨修复的种子细胞．成软骨分化过程涉及复杂的途径，包括转录和转录后水平调节，但它们在软骨分化中的准确机制尚未明确．

2 lncRNA DANCR的结构与功能

人类基因组中只有1%～2%可以转录翻译为蛋白质，约为2万条，70%被转录为非编码RNA（non⁃coding RNA，ncRNA）［10］．ncRNA依据转录本长度分为长链非编码RNA（200 nt～100 kb）和不同类型的小RNA（＜200 nt）．在过去几年中，基因测序发现成千上万种lncRNA，这些lncRNA尽管表达水平很低，但比编码基因有更高的组织特异性［11］，而且参与许多细胞生物进程，包括X染色体失活，调控基因在蛋白质合成、印记，细胞周期、分化的调控，转录和翻译［12－16］．lncRNA DANCR是由Kretz等［17］于2012年首先发现，它在表皮细胞中发挥去分化作用，维持表皮细胞处于未分化状态．对lncRNA最常用的分类方法是根据他们在基因组中相对于mRNA的位置，DANCR距离最近的蛋白编码基因是上游的USP46和下游的ERVMER34．DANCR转录本长度为855 bp，定位于人类4号染色体上，成熟的DANCR不包含外显子和内含子．DANCR正义链引物序列为：5’⁃GCGCCACTATGTAGCGGGTT⁃3’，反义链引物序列为：5’⁃TCAATGGCTTGTGCCTGTAGTT⁃3’．到目前为止，只有少数RNA的结构通过化学分析测定，然而这种方法只能揭示二级结构，不能显示三级结构［18］，因此DANCR的高级结构尚不清楚．通过细胞分级分离和亚细胞RNA⁃seq数据分析发现DANCR在细胞内主要定位于细胞质内，少部分定位于细胞核内［19］．DANCR已经被发现的功能主要有通过组蛋白修饰调控表皮细胞分化［5］

3 lncRNA DANCR调控关节软骨损伤修复的机制

骨关节炎患者软骨与正常软骨相比，有3007条lncRNA上调和1707条lncRNA下调［24］．Wang等［4］进行人骨髓间充质干细胞软骨分化与未分化的lncRNA芯片检测及生物信息学分析，与未分化组相比，成软骨分组高表达lncRNA有2166条，低表达lncRNA有1472条．最近研究发现lncRNA DANCR在关节软骨的损伤修复中异常高表达［5］，其可能通过多种途径调控软骨损伤修复．

3．1 DANCR可能断裂为某种miRNA发挥调控作用lncRNA是体内某些microRNA的前体，部分lncRNA含有包含miRNA的发夹结构，可以通过拼接或酶切等方式产生miRNA，如H19可以通过经典的Drosha⁃Dicer拼接方式产生miRNA⁃675．Huang等［25］进行BMSC向脂肪细胞分化的实验研究发现，在BMSC分化为脂肪细胞过程中，lncRNA H19和来自于lncRNA H19的microRNA⁃675（miR⁃675）表达显著下调．过表达H19和miR⁃675抑制脂肪形成，敲除他们的内源性表达可以加速BMSC向脂肪细胞分化．miR⁃675作用于组蛋白去乙酰化酶3’非翻译区（HDAC）4，5，6转录本，导致HDACs 4，5，6放松管制，后者是脂肪细胞分化的重要分子．反过来，曲古抑菌素A（一种HDAC抑制剂）显著降低CCCTC结合因子（CTCF）在印记控制区域的H19基因上游和随后下调H19的表达率．这些结果表明CTCF／H19／miR⁃675／HDAC调控通路在骨髓间充质干细胞向脂肪细胞发挥重要作用．已经证实在干细胞成软骨分化过程中存在着多条异常表达的miRNA，如miR⁃92a、miR⁃199a、miR⁃210、miR⁃145、miR⁃194等［26－28］，而在滑膜间充质干细胞向软骨细胞分化过程中DANCR显著高表达，DANCR转录本含有855 bp，其三级结构未知，很有可能其中某种异常表达的miRNA就来自于DANCR．

3．2 DANCR通过mRNAs／miRNA调控软骨的分化Zhang等［5］进行的人滑膜间充质干细胞向软骨分化的研究表明Sox4可以通过上调DANCR的表达促进SMSCs增殖和向软骨细胞分化．DANCR启动子包含一个Sox4结合基序（CAATGG），DANCR敲除能够降低Sox4基因高表达诱导的MSCs增殖、分化效果，所以DANCR很可能就是Sox4的靶基因．而在软骨分化过程中Sox基因家族与多种miRNA及mRNA存在着密切的联系，如Sox9的调控miR⁃29结合靶基因Col2a1的3’UTR的过程［29］

lncRNA可以作为miRNA的竞争性内源性RNA（competing endogenous，ceRNA），调控软骨细胞的发生、发展过程．Liu等［30］研究了lncRNAs在机械应力引起关节软骨退变过程中的机制，发现在软骨退变区lncRNA MSR明显上调．MSR作为miRNA⁃152的竞争性内源RNA，抑制TMSB4的表达，增加基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表达，参与ECM的降解，导致细胞骨架的破坏．

DANCR也有着类似MSR的作用机制．Yuan等［19］发现DANCR可以竞争性地结合CTNNB1的3’UTR来阻断下游相关miRNA（miR⁃214、miR⁃320a和miR⁃199a）对CTNNB1的抑制作用．体内的这一发现表明了一种新的涉及lncRNA、mRNA和miRNA的调控机制．lncRNAs的调控机制很大程度上依赖于特定的细胞内定位，通过核浆RNA分离和rtPCR检测发现DANCR主要存在细胞质内，而胞质内丰富的lncRNA通常参与转录后调控的miRNA或基因相互作用［31－32］．

3．3 DANCR能够增加胞质内β⁃catenin调控软骨的分化Wnt／β⁃catenin通路是MSCs向软骨细胞增殖分化过程中的重要通路［33］．在经典的Wnt／β⁃catenin信号通路中，无Wnt蛋白结合时，酪氨酸激酶Iα和糖原合酶⁃3β使β⁃catenin磷酸化，再经泛素化和蛋白酶体降解，维持胞质内β⁃catenin处于较低水平．当Wnt通路激活时，Wnt蛋白结合Fzd和LRP5／6，通过酪蛋白激酶使散乱蛋白磷酸化，抑制糖原合酶⁃3β活性，使得β⁃catenin在胞质内稳定、聚集，转移到细胞核内结合Tcf⁃Lef调控靶基因转录．在Zhang的实验中，Sox4过表达引起DANCR高表达，促进SMSCs成软骨分化，他认为可能的一种机制为Sox4通过上调β⁃catenin激活Wnt信号通路．而Yuan声称DANCR可以调节mRNA的稳定，表明DANCR对于β⁃catenin的作用可能是独立于Wnt信号通路．或许DANCR能够直接通过某种途径维持β⁃catenin在胞质内的稳定．这种调控途径可能是通过DANCR作用于糖原合酶⁃3β减弱其磷酸化功能；也可能DANCR直接结合于β⁃catenin，竞争或改变蛋白酶的结合位点，使得β⁃catenin不被蛋白酶识别降解．目前的研究表明DANCR能够通过增加细胞质内β⁃catenin含量，从而促进β⁃catenin进入细胞核内发挥软骨分化作用，具体DANCR通过何种方式增加β⁃catenin含量目前尚不清楚．

上述研究表明DANCR可能通过多种途径、多种机制在促MSCs成软骨分化与增殖过程中发挥着重要作用，具体哪种途径最主要，哪些是最关键的作用位点，哪种干预方法最有希望转化为临床应用，这些都还有待进一步的研究．

4 展望

软骨损伤与修复是一个复杂的调控过程，目前临床上对于骨关节炎等原因引起的软骨缺损尚无较好的处理方法．近年来，lncRNA在疾病的发生发展过程中的作用逐渐成为研究热点，lncRNA DANCR被发现在促MSCs成软骨分化与增殖过程中发挥重要作用．然而现阶段对于DANCR在软骨损伤修复中的作用机制研究非常少，尚有更多的未知机制等待研究．DANCR作为调控软骨形成、分化的重要调控物质，有望成为临床治疗骨关节炎或软骨损伤的一个突破点．

［1］Merceron C，Portron S，Masson M，et al．Cartilage tissue engineer⁃ing：From hydrogel to mesenchymal stem cells［J］．Biomed Mater Eng，2010，20（3）：159－166．

［2］Koga H，Engebretsen L，Brinchmann JE，et al．Mesenchymal stem cell⁃based therapy for cartilage repair：a review［J］．Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2009，17（11）：1289－1297．

［3］Mercer TR，Dinger ME，Mattick JS．Long non⁃coding RNAs：insights into functions［J］．Nat Rev Genet，2009，10（3）：155－159．

［4］Wang L，Li Z，Li Z，et al．Long noncoding RNAs expression signa⁃tures in chondrogenic differentiation of human bone marrow mesen⁃chymal stem cells［J］．Biochem Biophys Res Commun，2015，456（1）：459－464．

［5］Zhang L，Chen S，Bao N，et al．Sox4 enhances chondrogenic differ⁃entiation and proliferation of human synovium⁃derived stem cell via activation of long noncoding RNA DANCR［J］．J Mol Histol，2015，46（6）：467－473．

［6］Hochberg MC，Altman RD，April KT，et al．American College of Rheumatology 2012 recommendations for the use of nonpharmacologic and pharmacologic therapies in osteoarthritis of the hand，hip，and knee［J］．Arthritis Care Res（Hoboken），2012，64（4）：465－474．

［7］Orth P，Rey⁃Rico A，Venkatesan JK，et al．Current perspectives in stem cell research for knee cartilage repair［J］．Stem Cells Cloning，2014，7：1－17．

［8］Frith JE，Thomson B，Genever PG．Dynamic three⁃dimensional cul⁃ture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential［J］．Tissue Eng Part C Methods，2010，16（4）：735－749．

［9］Gómez⁃Barrena E，Solá CA，Bunu CP．Regulatory authorities and orthopaedic clinical trials on expanded mesenchymal stem cells［J］．Int Orthop，2014，38（9）：1803－1809．

［10］Djebali S，Davis CA，Merkel A，et al．Landscape of transcription in human cells［J］．Nature，2012，489（7414）：101－108．

［11］Cabili MN，Trapnell C，Goff L，et al．Integrative annotation of hu⁃man large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses［J］．Genes Dev，2011，25（18）：1915－1927．

［12］Fatica A，Bozzoni I．Long non⁃coding RNAs：new players in cell differentiation and development［J］．Nat Rev Genet，2014，15（1）：7－21．

［13］Hu W，Alvarez⁃Dominguez JR，Lodish HF．Regulation of mammali⁃an cell differentiation by long non⁃coding RNAs［J］．EMBO Rep，2012，13（11）：971－983．

［14］Vance KW，Ponting CP．Transcriptional regulatory functions of nuclear long noncoding RNAs［J］．Trends Genet，2014，30（8）：348－355．

［15］Quinodoz S，Guttman M．Long noncoding RNAs：an emerging link between gene regulation and nuclear organization［J］．Trends Cell Biol，2014，24（11）：651－663．

［16］Rinn JL，Chang HY．Genome regulation by long noncoding RNAs［J］．Annu Rev Biochem，2012，81：145－166．

［17］Kretz M，Webster DE，Flockhart RJ，et al．Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCR［J］．Genes Dev，2012，26（4）：338－343．

［18］Novikova IV，Hennelly SP，Tung CS，et al．Rise of the RNA machines：exploring the structure of long non⁃coding RNAs［J］．J Mol Biol，2013，425（19）：3731－3746．

［19］Yuan SX，Wang J，Yang F，et al．Long noncoding RNA DANCR increases stemness features of hepatocellular carcinoma by derepres⁃sion of CTNNB1［J］．Hepatology，2016，63（2）：499－511．

［20］Jia J，Li F，Tang XS，et al．Long noncoding RNA DANCR promotes invasion of prostate cancer through epigenetically silencing expression of TIMP2／3［J］．Oncotarget，2016，7（25）：37868－37881．

［21］Liu Y，Zhang M，Liang L，et al．Over⁃expression of lncRNA DANCR is associated with advanced tumor progression and poor prognosis in patients with colorectal cancer［J］．Int J Clin Exp Pathol，2015，8（9）：11480－11484．

［22］Zhu L，Xu PC．Downregulated LncRNA⁃ANCR promotes osteoblast differentiation by targeting EZH2 and regulating Runx2 expression［J］．Biochem Biophys Res Commun，2013，432（4）：612－617．

［23］Jia Q，Jiang W，Ni L．Down⁃regulated non⁃coding RNA（lncRNA⁃ANCR）promotes osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells［J］．Arch Oral Biol，2015，60（2）：234－241．

［24］Fu M，Huang G，Zhang Z，et al．Expression profile of long noncod⁃ing RNAs in cartilage from knee osteoarthritis patients［J］．Osteoar⁃thr Cartil，2015，23（3）：423－432．

［25］Huang Y，Zheng Y，Jin C，et al．Long Non⁃coding RNA H19 Inhibits Adipocyte Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells through Epigenetic Modulation of Histone Deacetylases［J］．Sci Rep，2016，6：28897．

［26］Zhang Z，Kang Y，Zhang Z，et al．Expression of microRNAs during chondrogenesis of human adipose⁃derived stem cells［J］．Osteoarthr Cartil，2012，20（12）：1638－1646．

［27］Yang B，Guo H，Zhang Y，et al．MicroRNA⁃145 regulates chondro⁃genic differentiation of mesenchymal stem cells by targeting Sox9［J］．PLoS ONE，2011，6（7）：e21679．

［28］Xu J，Kang Y，Liao WM，et al．MiR⁃194 regulates chondrogenic differentiation of human adipose⁃derived stem cells by targeting Sox5［J］．PLoS ONE，2012，7（3）：e31861．

［29］Yan C，Wang Y，Shen XY，et al．MicroRNA regulation associated chondrogenesis of mouse MSCs grown on polyhydroxyalkanoates［J］．Biomaterials，2011，32（27）：6435－6444．

［30］Liu Q，Hu X，Zhang X，et al．The TMSB4 Pseudogene LncRNA Functions as a Competing Endogenous RNA to Promote Cartilage Degradation in Human Osteoarthritis［J］．Mol Ther，2016，24（10）：1726－1733．

［31］Gong C，Maquat LE．lncRNAs transactivate STAU1⁃mediated mRNA decay by duplexing with 3’UTRs via Alu elements［J］．Nature，2011，470（7333）：284－288．

［32］Kretz M，Siprashvili Z，Chu C，et al．Control of somatic tissue differentiation by the long non⁃coding RNA TINCR［J］．Nature，2013，493（7431）：231－235．

［33］Inui A，Iwakura T，Reddi AH．Human stem cells and articular carti⁃lage regeneration［J］．Cells，2012，1（4）：994－1009．

Research progress on functional mechanisms of lncRNA DNACR on articular cartilage injury and repair

ZHANG Pin1，YANG Chao2，ZHAO Jiang⁃Ning3，ZHANG Lei3

1Department of Orthopedics，Jinling Clinical Medical College of NanjingMedicalUniversity（NanjingGeneralHospital），
2Department of Orthopedics，Clinical College of Medical School of Nanjing University（Nanjing General Hospital），3Department of Orthopedics，Nanjing General Hospital，Nanjing 210002，China

Long non⁃coding RNA（lncRNA）is an RNA molecule that is longer than 200 nucleotides and is not translated into a protein．LncRNAs participate in various biological processes．The repair of articular cartilage damage is always a hot and difficult point in joint surgery．Recent studies show that long non⁃coding RNA DANCR plays a key role in chondrogenic differentitation of human mesenchymal stem cells（MSCs）by interaction with miRNAs／mRNA and increasing the content of β⁃catenin in the cytoplasm．This article reviews the mechanism of DANCR in enhancing chondrogenhic differentiation and proliferation of human MSCs．

DANCR；miRNA；mesenchymal stem cells；carti⁃lage repair

R329．2

A

2095⁃6894（2017）03⁃62⁃04

2016－11－03；接受日期：2016－11－21

江苏省博士后基金（1501168b）；中国博士后基金（2016M592956）；南京总医院院管课题（2016003）

张 聘．硕士．研究方向：关节软骨修复．E⁃mail：1430640566＠qq．com

张 雷．博士，主治医师．E⁃mail：ra_eagle＠hotmail．com