乳腺癌基因治疗现状及进展

周 晔，邓新娜，范晓燕，李 阳，张丽霞，Andrew Chang，李庆霞

（1河北省人民医院，河北 石家庄 050000；2Rice University，USA Houston 77005）

乳腺癌基因治疗现状及进展

周 晔1，邓新娜1，范晓燕1，李 阳1，张丽霞1，Andrew Chang2，李庆霞1

（1河北省人民医院，河北 石家庄 050000；2Rice University，USA Houston 77005）

乳腺癌已经超越宫颈癌成为居于发展中国家女性肿瘤死亡率首位的恶性肿瘤，其发病率约占全身恶性肿瘤的23%，死亡率占14%．目前乳腺癌的治疗方法主要包括手术、放疗、化疗或联合治疗，但治疗效果有限，尤其是对三阴乳腺癌及晚期乳腺癌效果不佳，探索新的治疗方法刻不容缓．随着精准医疗概念的提出，乳腺癌的发生、转移、耐药机制、基因组学等分子水平的研究逐渐深入，推动了乳腺癌基因治疗地快速发展．目前，乳腺癌基因治疗主要包括癌基因治疗、抑癌基因治疗、免疫基因治疗、多药耐药基因治疗、自杀基因治疗、溶瘤病毒治疗、microRNA治疗等，本文将从上述治疗及进展方面进行综述．

乳腺癌；基因治疗；癌基因；免疫基因治疗；溶瘤病毒治疗；microRNA治疗

0 引言

乳腺癌的发生是以多个原癌基因在不同的时间和空间上，经不同途径激活或不同的抑癌基因失活为基础的多步骤过程．越来越多的癌基因、抑癌基因被发现与乳腺癌的发生相关，为癌基因的敲除治疗与新的肿瘤抑制机制探索提供了理论依据［1－2］．此外，乳腺癌的进展与复杂的肿瘤免疫微环境相关，如近年来研究较多的包括 GM⁃CSF、VEGF、IL⁃17、PD1 等［3－4］．针对肿瘤免疫微环境的基因治疗手段主要包括免疫基因治疗、溶瘤病毒治疗等，成为近年来乳腺癌基因治疗的新热点，并有望较早地实现临床转化．

乳腺癌的传统治疗手段主要包括手术、化疗、放疗、靶向治疗等．近年来，上述治疗方法疗效无明显突破，尤其对晚期及三阴型乳腺癌疗效欠佳．基因治疗即利用基因转染和基因重组的技术，将构建好的外源性治疗基因有效地导入细胞内，导入基因可以起到直接修复和纠正肿瘤发病相关基因的作用，从而达到治疗肿瘤的目的［5］，成为了新型治疗手段．目前常用的基因转染载体包括病毒载体（腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒等，其中最常用的是腺病毒）和非病毒载体（脂质体、纳米粒等，其中研究最多的是脂质体）［6］．常用的基因干预技术包括：反义RNA（antisense RNA）技术、RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术、核酶技术、反基因寡核苷酸技术（anti⁃sense oligonucleotides， ASO）［7－10］．siRNA、miRNA 与纳米颗粒技术在乳腺癌中的运用备受重视，其中siRNA技术已被广泛应用于肿瘤基因 治疗［11－12］．CRISPR⁃Cas9技术是近年来新兴的基因干预技术，CRISPR⁃Cas9系统是成簇的具有规律间隔短回文重复结构的基因编辑系统，利用这项技术可直接编辑或修改DNA序列，通过导入效应基因序列，实现激活、抑制、敲除靶基因的目的［13］．研究证实，在乳腺癌中通过应用CRISPR⁃Cas9技术和激酶抑制剂证实周期蛋白依赖性激酶7（cyclin⁃dependent protein kinases 7，CDK7）在三阴性乳腺癌中具有介导基因转录的重要作用［14］．另一项靶向阳离子微泡（cationic microbub⁃bles conjugated with a CD105 antibody， CMB105）技术用于体内基因转染，可通过对血管生成的抑制作用抑制乳腺癌种植瘤生长［15］．

综上，基于乳腺癌分子水平研究进展及基因干预技术进展，目前研究的乳腺癌基因治疗方法主要包括癌基因治疗、抑癌基因治疗、免疫基因治疗、多药耐药基因治疗、自杀基因治疗、溶瘤病毒治疗、microRNA治疗等措施．

1 癌基因治疗

与乳腺癌相关的癌基因包括：HER⁃2（c⁃erbB⁃2，neu）、Ras基因、C⁃myc 基因等［16］．抑制癌基因的表达是主要的癌基因治疗策略．目前常用的方法有：①反义核苷酸、核酸或siRNA阻止癌基因mRNA转录和翻译．近年来，为增强对癌基因表达的阻断，增加癌基因治疗效果，国内对同时阻断双癌基因表达的研究越来越多．陈邵坤等［17］研究将 rAd⁃hTERT和rAd⁃TRF2重新构建，制备双表达 siRNA⁃hTERT 和siRNA⁃TRF2重组腺病毒，并转染 MCF⁃7细胞，结果显示重组腺病毒对MCF⁃7细胞的增殖周期及集落形成的抑制能力均较单基因腺病毒强．②转染显性负突变体（dominant negativemutation）干扰癌细胞的信号转导，抑制癌细胞生长．显性负突变体是一种因结构发生变化而失去正常生物学功能的蛋白质分子，可与相应野生型蛋白进行竞争性抑制而阻断后者的生物学功能．研究［18］显示将雌激素受体显性负突变体转导入雌激素受体（＋）的乳腺癌细胞中，能够显著抑制癌细胞生长．另一项研究［19］显示，将端粒酶逆转录酶显性负突变体（DN⁃hTERT）转染入乳腺癌细胞MCF7中，DN⁃hTERT的异常表达能够显著抑制癌细胞端粒酶活性及长度，从而导致癌细胞生长抑制及凋亡，并影响其体内致瘤性．③使用癌基因抑制剂阻断癌基因磷酸化水平及其下游的信号传导通路．Luttrell等［20］证实，使用癌基因 c⁃Src抑制剂 PP2通过阻断其磷酸化及MAPK和AKt两条细胞生长信号通路来阻断癌基因活性，从而抑制癌细胞生长．目前，c⁃Src抑制剂已经被用于乳腺癌的临床验证阶段［21－22］．另外，Korcn等［1］研究发现新的癌基因 PIK3CA（H1047R）突变不仅可以诱导乳腺癌的形成，亦可调控乳腺癌细胞的异质性，与不同类型乳腺肿瘤和临床预后相关，为PIK3CA基因敲除治疗打下基础．

2 抑癌基因治疗

抑癌基因是指正常细胞内存在的、能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群．通过转染功能正常的抑癌基因至乳腺癌细胞，恢复细胞的正常生长或者诱导肿瘤细胞凋亡是抑癌基因治疗主要策略［23－26］．目前已分离克隆的乳腺癌抑癌基因主要有p53、Rb、ERBA、WT1、DCC、MCC、APC、nm23、MTS、TIMP、FHIT、ING1 、BRCA1 和 BRCA2等，以 p53、ING1、BRCA1和BRCA2等实验研究较多．Prabha等［27］以纳米微粒（nanopa rticles）介导野生型p53基因导入乳腺癌细胞系，发现其能有效抑制小鼠体内乳腺癌细胞的增殖．近年来新发现的抑癌基因包括 FHIT、WWOX 等［28－29］．Ge 等［29］研究发现， 在乳腺癌中WWOX的抑癌作用是通过抑制癌基因KLF5翻译，减少KLF5蛋白表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖．近年来，除对P53基因研究相对深入外，抑癌基因治疗方法进展相对缓慢，缺乏特异性及高效性，但2017年Nature中发表的一项新的研究［3］显示，线粒体蛋白质LACTB能够有效地抑制乳腺癌细胞的增殖．其作用机理是通过减少线粒体磷脂酰丝氨酸脱羧酶的水平改变线粒体脂质代谢，影响乳腺癌细胞的分化．该研究不仅发现了一种新的线粒体抑癌基因，而且证明线粒体脂质代谢与乳腺癌细胞分化程序之间的关系，从而揭示出之前从未描述过的肿瘤抑制机制，为抑癌基因治疗的发展提供新思路．

3 免疫基因治疗

乳腺癌是一种具有免疫原性的肿瘤，随着肿瘤发生与机体免疫系统关系的研究逐步深入，免疫基因治疗（immunogene therapy）在近年来取得了突破性的进展，弥补了既往免疫基因治疗研究的不足．免疫基因治疗是通过基因重组技术在基因水平激发机体抗肿瘤免疫或提高肿瘤细胞的免疫原性．主要包括3种方法：①细胞因子基因治疗．肿瘤的发生与肿瘤患者的细胞因子表达有关，因此，通过细胞因子网络增强机体抗肿瘤免疫达到清除肿瘤的目的一直是该领域研究的一个热点．将某些细胞因子（如 IL⁃2、IL⁃4、IL⁃12、TNF⁃α、GMCSF 等）的基因或受体基因转染到机体免疫细胞中，从而激活机体的抗肿瘤免疫反应．研究发现 DISC⁃hGMCSF能够高效转染人乳腺癌细胞，分泌 GM⁃CSF；DISC⁃hGMCSF在4T1 中可有效抑制肿瘤生长，与化疗药物联合使用时效果不受影响［30］．②肿瘤疫苗治疗．一种为抗原特异性疫苗，HER2和MUC1是两个研究较多的乳腺癌特异性抗原，抗原特异性疫苗的制备能够有效提高患者的免疫应答能力［31－32］．一项纳入 195 名 HER2 阳性乳腺癌患者的Ⅰ／Ⅱ期临床实验研究显示，同时应用HER2介导的MHCI类分子E75肽及GM⁃CSF治疗的患者5年DFS（89．7%）高于单纯应用 GM⁃CSF 治疗的对照组的 5 年 DFS（80．2%），且局部无明显不良反应［33］．另一种为DC介导的疫苗，体外合成负载肿瘤抗原的DC疫苗然后应用于患者体内，DC细胞将提呈肿瘤抗原并激活体内免疫反应或直接依靠DC疫苗的作用起到免疫治疗作用［34］．在一项Ⅱ期临床实验中，26名已经被证实疾病进展的乳腺癌患者结束P53DC疫苗治疗，其中19名持续了6周期的疫苗接种，42%的患者疗效评价为SD，说明P53DC疫苗治疗有效［35］．③免疫卡控点治疗．基因的改变会导致许多免疫靶点被免疫系统识别，然而因信号通路的异常免疫系统往往不能发挥正常的免疫反应．免疫卡控点在细胞表面分子调节免疫应答中发挥重要的生理作用，防止自身免疫，并保持自身耐受性［36－37］．这些表面受体或配体调控肿瘤免疫抑制微环境，抑制初始T细胞和浸润T细胞的激活．免疫卡控点的靶向抑制抗体在乳腺癌的治疗中体现出了巨大的潜能［38－39］．目前，针对乳腺癌免疫卡控点CTLA⁃4、PD⁃1或淋巴细胞激活基因3（lymphocyte activation gene 3， LAG⁃3）通路的靶向治疗仍在试验阶段，其可能成为未来乳腺癌免疫基因治疗的新趋势［40］．

4 自杀基因治疗

自杀基因（suicide gene）是指能将无毒的药物前体转化为细胞毒性物质的基因．转染了自杀基因的肿瘤细胞可被直接杀伤，且其周围大量未被转染的细胞也被杀死，出现旁观者效应，且无放化疗等不良反应［41－42］．目前已发现和克隆应用于乳腺癌治疗研究的自杀基因系统（基因介导的酶／药物前体治疗系统，GEPT）包括多种，其中 HST⁃TK／GCV、CD／5⁃FC 系统是最常用也是研究最多的治疗系统，且越来越多的自杀基因系统被发现［43－44］．Kuo 等［45］研究显示，STAT3／NF⁃κB通路可以在基质细胞以及肿瘤干细胞中持续激活，转染 STAT3／NF⁃κB 基因以驱动 HST⁃TK／GCV系统，可以治疗顺铂耐药的三阴乳腺癌．另外，双自杀基因系统可提高单系统治疗效果，国内研究较多的是腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合（CD／TK） 的双自杀基因系统［46－47］．一项新的研究［48］显示，HSV1⁃sr39TK⁃NTR／GCV⁃CB1954 双自杀基因系统较单自杀基因系统对三阴性乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231具有更高的杀伤活性．目前，新的研究进展为基于应用自杀基因系统的转基因干细胞疗法（genetically engineered stem cells， GESTECs）被用于治疗乳腺癌．研究［49］发现，许多来源于骨髓或脂肪组织的干细胞，如神经干细胞（neural stem cell，NSC），神经祖细胞和骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）均具有永生性及肿瘤趋向性，因此，可将自杀基因TK等转染入干细胞，并利用干细胞的永生性及肿瘤趋向性靶向治疗乳腺癌．

5 多药耐药基因治疗

多药耐药（multiple drug resistance，MDR）是指肿瘤细胞接触一种抗癌药物产生的耐药同时也对其他结构和作用机制不同的药物获得耐药［50］．肿瘤细胞的多药耐药性及大剂量化疗的严重骨髓抑制是化疗失败的主要原因．目前已发现多种多药耐药基因：MDR1、MDR3、ABCG2、ABCC1、ABCC2 等［51］， 其中MDR1与肿瘤细胞典型多药耐药有关，其编码P⁃gp蛋白至肿瘤细胞对多种药物通透性降低导致耐药［52］．Zhang 等［53］的研究表明用阳离子聚合物转染siRNA进入乳腺癌细胞，沉默MDR1基因，下调P⁃gp蛋白的表达以减少阿霉素流出癌细胞外，从而逆转癌细胞对阿霉素的多药耐药．另外，既往研究显示将药物增敏基因导入肿瘤细胞增加药物敏感性，或将耐药基因导入骨髓细胞增加骨髓对化疗药物的耐受性，均可改善多药耐药［54］．

6 溶瘤病毒治疗

溶瘤病毒治疗（oncolytic virotherapy）的原理为通过对自然界存在的一些致病力较弱的病毒进行基因改造，转染具有特定功能的抗肿瘤细胞或肿瘤微环境的基因，制成特殊的溶瘤病毒，通过病毒对肿瘤细胞的直接杀伤作用和诱导全身性抗肿瘤免疫反应两种作用机制治疗肿瘤．因正常机体细胞存在抗病毒能力且无法无限复制病毒而使溶瘤病毒对其不具有杀伤作用，因此，近年来，溶瘤病毒的研究成为抗肿瘤治疗的新热点［55］．最常用的溶瘤病毒包括DNA病毒［腺病毒、单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）和牛痘病毒］和RNA病毒［麻疹病毒、呼肠孤病毒和鸡新城疫病毒（newcastle disease virus， NDV）］．Kochneva等［56］研究显示，双重组痘苗病毒（VV⁃GMCSF⁃Lact）增强抗肿瘤蛋白Lactaptin的表达和人类集落刺激因子（granulocyte⁃macrophage colony stim⁃ulating factor，GM⁃CSF） 抗肿瘤活性，对乳腺癌细胞MCF⁃7具有更高的靶向性，并能够有效抑制肿瘤细胞的生长．Hernandez等［57］将对低氧和雌激素反应的双特异启动子插入人类腺病毒⁃5型基因组的E1A和E4区，利用该系统构建了AdEHT2和AdEHE2F，从而杀死低氧条件和雌激素受体阳性的乳腺癌细胞．近期研究［58］发现，溶瘤病毒已经被应用在许多联合治疗策略以增加其对乳腺癌的有效性．例如化疗药物紫杉醇可以增加表达IL⁃12的腺病毒的摄取和细胞毒性．目前溶瘤病毒的研究已经进入临床试验阶段［59］．

7 microRNA治疗

microRNA（miRNA，miR）是调节功能基因表达的重要调控分子，是由19～25个核苷酸组成的、非编码的单链RNA，被称为微小核糖核酸．多种microRNA参与肿瘤的恶性转变过程，如恶性增殖、复发转移、凋亡抑制等［60］．关于microRNA研究的新进展包括以下两方面：①越来越多的证据显示，一些已知的microRNA在乳腺癌患者中异常活跃，将其作为早期乳腺癌的生物标志物及其预测预后的相关研究已进入临床试验阶段［61］．例如 let⁃151a，miR⁃21，miR⁃155，miR⁃145，miR⁃18a，miR⁃16 以及组织特异性的 miRNAs，例如 miR⁃182，miR⁃145，miR⁃21，miR⁃155／154，miR⁃203，miR⁃213，miR⁃7．②多项研究显示 microRNA 与耐药性有关，例如 miR⁃200c、miR⁃34a、miR⁃134，主要机制为microRNA能抑制各种信号通路所必需的基因或药物诱导细胞凋亡呈现细胞耐药［62］．Kastl等［63］研究发现，在多西紫杉醇耐药的乳腺癌细胞模型中，miR⁃34a及 miR⁃141 均过表达，然而受 miR⁃34a调控的 bcl⁃2、CCND1 基因表达减少，抑制 miR⁃34a 的过表达可逆转多西紫杉醇耐药的乳腺癌细胞的耐药性．

8 面临的问题和前景展望

近年来，随着乳腺癌相关基因的发现，乳腺癌发病分子机制的研究以及分子生物学技术的发展，乳腺癌基因治疗各个领域的研究均取得新进展，为乳腺癌尤其是晚期乳腺癌的治疗提供了新手段、新思路．例如癌基因治疗中新癌基因PIK3CA的发现，双癌基因干扰治疗，抑制癌细胞端粒酶活性治疗，抑癌基因治疗中线粒体抑癌基因的新发现，自杀基因治疗中转基因干细胞疗法的理论，溶瘤病毒治疗中双重组溶瘤病毒的研发等均成为乳腺癌基因治疗研究的新热点．更为重要的是免疫基因治疗突破了既往T细胞及DC疫苗的单一研究方向，在肿瘤相关抗原、新的免疫卡控点及共刺激分子等领域作出许多新的研究．其中发现与乳腺癌相关的包括肿瘤相关抗原 HER⁃2、Mucin 1等新的免疫卡控点 CTLA⁃4、PD⁃1 及共刺激分子CD40，OX40和4⁃1BB等及多种细胞因子．这些乳腺癌免疫基础分子水平的研究，为乳腺癌免疫基因治疗提供了深厚的理论依据，为推动免疫基因治疗的快速发展打下了坚实的基础．

虽然基因治疗的研究取得了可喜成果，但大多数仍停留在细胞或动物实验，仅肿瘤疫苗治疗及溶瘤病毒治疗等少数方法进入临床试验阶段．实现基因治疗的临床转化是目前的研究方向与目标，但仍存在许多有待解决的问题．首先，基因转染方法种类多，技术相对成熟，但转染效率及稳定性仍不稳定；缺乏特异高效的基因载体，肿瘤细胞被导入基因效率低，治疗效果会受到影响，而载体特异性差会导致正常细胞受累，且目前多用病毒为载体，其伦理性及致病性问题仍未能完善解决；基因转染后可控性及安全性不佳．当基因转导入体内后，目前的技术无法精确控制其表达部位及表达程度，因此绝大多数研究主张用特异性基因启动子控制靶基因的表达，以此达到弥补基因表达部位及表达程度不精确等缺陷的目的．因此寻找稳定的基因转染方法、研发高效特异且持续表达的载体及控制转染基因的表达仍是今后基因治疗研究的重要问题．其次，至今为止，虽然越来越多的与乳腺癌相关的基因被发现，但仍未确定靶向致病基因．靶向致病基因未明确是导致基因治疗无突破性进展的关键问题．再次，肿瘤异质性和肿瘤微环境的复杂性意味着依靠单一方法治愈乳腺癌的机会是微乎其微的．只阻断某一单基因不能高效抑制或者逆转肿瘤细胞的生长，无法达到理想的治疗效果［64］．

未来，传统疗法与基因治疗的联合治疗或基因治疗间的相互联合成为根治乳腺癌的新趋势［64－66］，其不仅可以通过各种各样的机制抑制肿瘤细胞增殖，而且可以降低肿瘤组织耐药的发生，减少身体的不良反应发生率．因此，我们根据肿瘤的个体化特性，联合使用两种或者多种手段治疗肿瘤，可以更好地提高肿瘤治疗的效果以及有效性．另外，基因治疗进入临床试验还涉及伦理、剂量、途径及安全等问题，因此在深入研究的同时也需要得到多方面关注．

随着乳腺癌发病机制及分子生物学研究的不断深入与完善，乳腺癌的基因治疗将会为乳腺癌的根治带来希望．

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Current situation and progress in gene therapy of breast cancer

ZHOU Ye1， DENG Xin⁃Na1， FAN Xiao⁃Yan1， LI Yang1， ZHANG Li⁃Xia1， Andrew Chang2， LI Qing⁃Xia11HeBei General Hospital， Shijiazhuang 050000， China；2Rice University， Houston 77005， USA

Breast cancer is superceding cervical cancer as the leading cause of cancer death among females in most economically developing countries，and accounts for 23%of the total cancer cases and 14%of the cancer deaths．Various therapeutic strategies are available， including surgery， chemotherapy， radiotherapy and their combinations．However， their therapeutic effect is still limited，particularly on advanced breast cancer and triple negeative breast cancer．Therefore new therapies for metastatic breast cancer patients are urgently needed．With the rise of precision medicine，the researches of carcinogenesis， metastasis， medical resistance，immunotherapy，genomics in molecular level of breast cancer have made great achievements，which greatly promoted the development of gene therapy．The gene therapies mainly include cancer gene therapy， tumor⁃suppressorgene therapy， immunogenetherapy，multi⁃drug resistant gene therapy， suicide gene therapy， oncolytic virotherapy， microRNA therapy， etc．This review will summarize the current situation and progresses in gene therapies of breast cancer．

breast cancer； gene therapy； cancer gene； immu⁃nogene therapy； oncolytic virotherapy； microRNA therapy

R73

A

2095⁃6894（2017）09⁃78⁃06

2017－05－25；接受日期：2017－06－10

河北省2017年度医学科学研究重点课题计划（20170028）；2015年政府资助临床医学优秀人才培养和基础课题研究项目计划（361003）

周 晔．硕士．E⁃mail：zhouye314＠ 126．com

李庆霞．博士，教授，主任医师，硕导．E⁃mail：lqx73＠163．com