结直肠癌基因治疗进展

高兆亚，王延召，雷福明 （北京大学首钢医院胃肠外科，北京100144）

结直肠癌基因治疗进展

高兆亚，王延召，雷福明 （北京大学首钢医院胃肠外科，北京100144）

结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，在全球范围内造成严重的人口和经济负担．基因治疗是通过运用核酸（DNA或者RNA）治疗或者预防人类疾病．近年来，结直肠癌基因治疗备受人们青睐，许多研究成果成功运用于临床．目前结直肠癌基因治疗的主要方法有免疫基因治疗、自杀基因治疗、基因修正治疗和溶瘤病毒治疗．本文旨在总结结直肠癌基因治疗的进展．

结直肠癌；基因治疗；癌基因；病毒载体

0 引言

结直肠癌是常见恶性肿瘤，全球每年约有120万人被诊断为结直肠癌［1］．在中国，结直肠癌发病率不断上升，2017年国家癌症中心数据显示，结直肠癌居于恶性肿瘤发病第五位，死亡率位于第五位［2］．随着癌症的早期筛查、外科手术方式的改进以及分子靶向、免疫靶向药物的出现，结直肠癌的治疗水平有了长足的进步［3］．但是晚期结直肠癌的治疗不尽人意．新方法的探索为结直肠癌的治疗提供了新思路．

肿瘤细胞的生长与凋亡受癌基因与抑癌基因的调控，从而达到一个动态平衡．随着分子生物学技术和理论的迅速发展以及对肿瘤免疫机制的深入研究，基因治疗已逐渐成为一种有希望的新方法．自1990年9月出现世界上首例基因治疗试验，基因治疗的研究进展迅速，同时也给结直肠癌的治疗带来新的希望．

1 基因治疗

基因治疗是从基因水平调控体内癌基因、抑癌基因、癌相关基因的表达，以及利用各种方法导入不同的目的基因，利用基因产物的功能直接或间接治疗疾病的治疗方法，也就是“以基因作为靶点的治疗”．证据表明，基因疗法可用于预防、减轻或治愈潜在的疾病，包括癌症、传染性疾病、遗传及自身免疫性疾病［4］．其中超过64%的基因治疗是针对实体及血液肿瘤［5］．目前肿瘤的基因治疗策略主要有基因修正、自杀基因、免疫基因、溶瘤病毒、基因抑制等．

2 基因修正治疗

基因治疗的初衷是基因修正，而在肿瘤的治疗方面，基因修正治疗却不尽人意．正常功能基因通过载体转染肿瘤细胞，置换或增补肿瘤细胞缺陷的基因，主要是以病毒为载体把野生型基因重新导入肿瘤细胞．结直肠癌的发生是一个多基因多步骤的过程，它涉及许多癌基因和抑癌基因的激活、失活．当前研究中与结直肠癌密切相关的抑癌基因主要有 p53、MCC、APC、p16等，其中p53是研究热点．以腺病毒介导的p53表达可明显抑制细胞分化，并诱导细胞凋亡．

p53以及抑癌基因的研究经过数十年的努力才得以稳步前进，终将带来癌症治疗领域的新曙光．

3 自杀基因治疗

自杀基因治疗主要有两种：前体药物转换酶基因治疗和毒素基因治疗．经典的自杀基因治疗是将前体药物转换酶基因转入肿瘤细胞中，该基因表达的生物酶可以使无毒的药物前体在肿瘤中代谢转变为有细胞毒性的药物，从而杀死肿瘤细胞．而毒素基因治疗的基础是毒素基因表达的毒性蛋白干扰细胞膜的稳定性，从而影响肿瘤细胞的生存能力．

前体药物转换酶基因有：胞嘧啶脱氨酶、单纯疱疹病毒⁃胸苷激酶（HSV⁃tk）、细胞色素 P450⁃2B1、硝基还原酶及其变异．结直肠癌自杀基因治疗研究中最广泛的是胞嘧啶脱氨酶（转换前提药物5⁃氟胞嘧啶（CD／5⁃FC）和单纯疱疹病毒⁃胸苷激酶（转换前提药物丙氧鸟苷 HSV⁃tk／GCV）．目前研究热点是通过基因突变或者融合蛋白的方式产生更有效的细胞毒性药物［6］，或者将自杀基因联合溶瘤病毒［7］．Yamada等［8］通过表达胞嘧啶脱氨基酶的溶瘤单纯疱疹病毒阐述了病毒的复制、基因的表达和前体药物的活化之间的关系．该研究在小鼠结直肠癌模型上进行，实验发现，早期加入5⁃FC相对于晚期加入有更大的细胞毒性；病毒瘤内注射后第6天转换5⁃FC成5⁃氟尿嘧啶（5⁃FU）的效率最高，治疗效果最好．

自杀基因表达毒性蛋白直接作用于肿瘤细胞，这种新的策略逐渐取代前体药物转换酶基因治疗，成为自杀基因治疗的新方法．经典的自杀基因治疗仅仅作用于分裂期细胞，破坏DNA合成，而这种新的毒性基因表达的蛋白也可以作用于静止期肿瘤细胞．Boulaiz等［9］利用逆转录病毒为载体携带凋亡素基因（apoptin）和鸟苷酸交换因子（gef）转染 DLD⁃1 人结直肠癌细胞株，结果显示同时表达apoptin和gef两种基因比只表达其中一种基因的病毒载体，更能促进细胞凋亡和抑制细胞活性．

4 免疫基因治疗

机体抗肿瘤的免疫主要依赖于肿瘤细胞的抗原被机体免疫系统识别后激活．人类肿瘤免疫原性弱，且抗原呈递中存在多个环节缺陷，从而使肿瘤出现免疫逃逸．免疫基因治疗的主要策略是把肿瘤免疫相关基因导入人体，增强肿瘤的免疫原性以及机体对肿瘤抗原的识别和提呈，以激活有效的免疫应答．

通过输入细胞因子基因，该基因产物能增强机体免疫功能，使宿主产生有效的抗肿瘤免疫反应．常用 的 细 胞 因 子 有 IL⁃6［10］、 IL⁃24［11］、 IL⁃15［12－13］、IL⁃12［14］．He 等［15］运用质粒载体将 IL⁃15 导入到负荷SW480肿瘤细胞小鼠体内．在荷瘤小鼠体内IL⁃15超表达，抑制肿瘤细胞的生长，同时延长小鼠存活时间．

另一方面，也可通过输入免疫相关基因刺激机体产生主动免疫功能，达到治疗肿瘤的目的．Zhao等［16］使用腺病毒为载体构建表达趋化因子 CCL21和细胞因子 IL⁃15 基因的病毒 Ad⁃CCL21⁃IL⁃15．在结直肠癌荷瘤小鼠行瘤内注射病毒后能显著抑制肿瘤生长．另外，经 AdCCL21⁃IL⁃15治疗后小鼠体内能产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞免疫反应，IFN⁃γ表达水平比对照组高［17］．

重组的基因疫苗常常是表达肿瘤相关抗原裸露的质粒DNA，直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答．基因疫苗是近年来基因治疗研究中所衍生并发展起来的一个新的研究领域．目前应用较多的肿瘤相关抗原有Her2／neu，MART1，PSA，CEA 等［18］．Parkhurst等［19］通过将鼠源性CEA抗体导入到3例拒绝标准治疗的结直肠癌转移患者体内，3例患者均被观察到血清CEA水平降低了74%～99%，并且其中1例肝、肺转移结直肠癌患者生存质量有明显的提高．研究发现p53在多数肿瘤中是突变状态，在肿瘤患者中是低免疫原性，这限制其成为抗肿瘤疫苗．

5 溶瘤病毒

溶瘤病毒（oncolytic virus）治疗肿瘤是基于病毒选择性地在肿瘤细胞内大量复制最终破坏肿瘤细胞，释放子代感染周边肿瘤细胞，在瘤体内广泛播散，而对正常组织细胞无杀伤作用［20］．肿瘤细胞裂解后释放原始抗原和热休克蛋白，导致强烈的机体抗肿瘤免疫效应．临床实验已用多种溶瘤病毒对结直肠肿瘤进行治疗，例如腺病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒等［21］．这些病毒不能在正常细胞中复制，而可以选择性地在肿瘤细胞中复制，通过不断增殖导致肿瘤细胞的裂解死亡．

Eveno等［22］采用改造的溶瘤痘苗病毒GLV⁃1h153表达人钠碘转运体基因行体外实验，该病毒能感染复制并溶解人结直肠腺癌细胞．在小鼠结直肠癌腹膜转移模型上腹腔注射GLV⁃1h153后，肿瘤显著减小．NV1020（转基因溶瘤单纯疱疹病毒）Ⅰ／Ⅱ期临床试验［23］以转移性结直肠癌患者为研究对象，Ⅰ期13例患者通过肝动脉注射 NV1020后出现短暂的发热而无其他不适，试验证实NV1020是安全的．Ⅱ期入组多线治疗后病情仍进展的患者22例，注射 NV1020后，50%患者病情稳定．继续化疗后整体肿瘤控制率为68%，其中部分缓解1例，病情稳定14例，中位生存期延长6．4个月．因此 NV1020在结直肠癌肝转移患者中具有良好疗效且不良反应小．目前，一项NV1020联合细胞毒性药物或靶向药物杀伤肿瘤细胞的大型随机Ⅱ／Ⅲ期临床试验正在开展．

6 基因抑制治疗

基因抑制治疗主要是干扰基因的转录和翻译，这些基因参与肿瘤的生长、转移和治疗抵抗．miRNA参与多种肿瘤信号通路，控制细胞内稳态，因此，沉默过表达的致癌miRNA以及恢复表达下调抑瘤性miRNA会抑制肿瘤的生长和发展，引起细胞凋亡，降低细胞生存能力［24－25］．

反义基因治疗基本机制是通过阻抑从DNA到mRNA的转录过程或从mRNA到蛋白质的翻译过程，沉默过表达的致癌miRNA而阻断细胞中蛋白质的合成．利用这一技术所研制的药物称为反义药物，通常指反义寡脱氧核苷酸和反义寡核苷酸［26］．反义基因治疗概念通俗易懂、设计简单、费用低，在过去二十年中发展快速．研究［27］发现，反义寡脱氧核苷酸能阻挠结肠癌细胞β⁃联蛋白mRNA功能，降低结肠癌胞质内β⁃联蛋白表达水平，从而抑制 β⁃联蛋白进入核内与转录因子结合启动下游靶基因转录．Najar等［28］研究发现 EGFR反义核苷酸能减少 EGFR、MAPK1、STAT5基因表达，降低结直肠癌细胞系的扩增．

另一种基因抑制策略是RNA干扰（RNA interfer⁃ence，RNAi）．RNAi属于转录后基因沉默机制，其本质是小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）高效特异地阻断体内同源基因表达，致使mRNA降解，基因表达受抑，是一种序列特异性的转录后基因沉默的过程［29］．RNAi技术可以对非正常上调的肿瘤相关基因进行特异性表达抑制，使其处于沉默或休眠状态，进而达到抑制肿瘤细胞生长的目的［30］．

通过恢复具有肿瘤抑制作用的miRNA来治疗结直肠的研究较多，主要通过转录miRNA类似物、miRNA前体以及化学修饰的寡核苷酸等来抑制结直肠癌细胞系的肿瘤［31－33］．而以上多数研究结果缺乏体内试验的证据，有待深入研究．

RNAi可以单独应用，也可与其他治疗手段联合应用．RNAi正在替代反义核苷酸技术及基因剔除技术在基因功能研究上的地位．基因沉默技术应用于临床中，首先必须做到精确的靶向沉默，避免脱靶效应，同时必须考虑到基因沉默对机体产生的副作用，例如对正常基因的沉默以及异源性而引起免疫反应等［33］．

7 结语

基因治疗在取得一定疗效的同时，也存在着基因载体的导入效率低、精确性较差及外源基因在体内表达的可控性差等缺点．目前基因治疗多数停留在Ⅰ期临床试验阶段，很少能进入Ⅱ、Ⅲ期临床试验．随着定向性传输技术、CRISPR／Cas9基因编辑技术、肿瘤精确治疗的发展，癌症治疗逐渐进入基因治疗的时代．以患者个体基因组基础，定制个性化精确治疗方案将是未来治疗肿瘤的终极方法．肿瘤治疗之路，任重道远．

［1］Siegel R， Desantis C， Jemal A．Colorectal cancer statistics，2014［J］．CA Cancer J Clin，2014，64（2）：104－117．

［2］Chen W， Zheng R， Zhang S， et al．Cancer incidence and mortality in China， 2013［J］．Cancer Lett，2017，401：63－71．

［3］Jemal A， Ward EM， Johnson CJ， et al．Annual report to the nation on the status of cancer，1975－2014， featuring survival［J］．J Natl Cancer Inst，2017．

［4］Misra S．Human gene therapy：a brief overview of the genetic revolu⁃tion［J］．J Assoc Physicians India，2013，61（2）：127－133．

［5］Ginn SL， Alexander IE， Edelstein ML， et al．Gene therapy clinical trials worldwide to 2012 ⁃an update［J］．J Gene Med，2013，15（2）：65－77．

［6］Giang I， Boland EL， Poon GM．Prodrug applications for targeted cancer therapy［J］．AAPS J，2014，16（5）：899－913．

［7］Miest TS， Cattaneo R．New viruses for cancer therapy：meeting clinical needs［J］．Nat Rev Microbiol，2014，12（1）：23－34．

［8］Yamada S， Kuroda T， Fuchs BC， et al．Oncolytic herpes simplex vi⁃rus expressing yeast cytosine deaminase：relationship between viral replication， transgene expression， prodrug bioactivation［J］．Cancer Gene Ther，2012，19（3）：160－170．

［9］Boulaiz H， Aránega A， Cáceres B， et al．A novel double⁃enhanced suicide gene therapy in a colon cancer cell line mediated by gef and apoptin［J］．BioDrugs，2014，28（1）：63－74．

［10］Alshamsan A．Induction of tolerogenic dendritic cells by IL⁃6⁃secre⁃ting CT26 colon carcinoma［J］．Immunopharmacol Immunotoxicol，2012，34（3）：465－469．

［11］Ma YF， Ren Y， Wu CJ， et al．Interleukin （IL）⁃24 transforms the tumor microenvironment and induces anticancer immunity in a murine model of colon cancer［J］．Mol Immunol，2016，75：11－20．

［12］Xia Y，Chen B， Shao X， et al．Treatment with a fusion protein of the extracellular domains of NKG2D to IL⁃15 retards colon cancer growth in mice［J］．J Immunother，2014，37（5）：257－266．

［13］Liang X， Luo M， Wei XW， et al．A folate receptor⁃targeted lipoplex delivering interleukin⁃15 gene for colon cancer immunotherapy［J］．Oncotarget，2016，7（32）：52207－52217．

［14］Luo M， Liang X， Luo ST， et al．Folate⁃modified lipoplexes delive⁃ring the interleukin⁃12 gene for targeting colon cancer immunogene therapy［J］．J Biomed Nanotechnol，2015，11（11）：2011－2023．

［15］He X， Li W， Wang Y， et al．Inhibition of colon tumor growth by IL⁃15 immunogene therapy［J］．Mol Med Rep，2012，5（1）：96－102．

［16］Zhao DX， Li ZJ， Zhang Y， et al．Enhanced antitumor immunity is elicited by adenovirus⁃mediated gene transfer of CCL21 and IL⁃15 in murine colon carcinomas［J］．Cell Immunol，2014，289（1－2）：155－161．

［17］Hernandez⁃Alcoceba R， Berraondo P．Immunochemotherapy againstcolon cancer by gene transfer of interleukin⁃12 in combination with oxaliplatin［J］．Oncoimmunology，2012，1（1）：97－99．

［18］Senovilla L， Vacchelli E， Garcia P， et al．Trial watch：DNA vaccines for cancer therapy［J］．Oncoimmunology，2013，2（4）：e23803．

［19］Parkhurst MR， Yang JC， Langan RC， et al．T cells targeting carci⁃noembryonic antigen can mediate regression of metastatic colorectal cancer but induce severe transient colitis［J］．Mol Ther，2011，19（3）：620－626．

［20］Russell SJ， Peng KW， Bell JC．Oncolytic virotherapy［J］．Nat Bio⁃technol，2012，30（7）：658－670．

［21］Parato KA， Breitbach CJ， Le Boeuf F， et al．The oncolytic poxvirus JX⁃594 selectively replicates in and destroys cancer cells driven by genetic pathways commonly activated in cancers［J］．Mol Ther，2012，20（4）：749－758．

［22］Eveno C，Mojica K，Ady JW，et al．Gene therapy using therapeutic and diagnostic recombinant oncolytic vaccinia virus GLV⁃1h153 for management of colorectal peritoneal carcinomatosis［J］．Surgery，2015，157（2）：331－337．

［23］Geevarghese SK， Geller DA， De Haan HA， et al．Phase Ⅰ／Ⅱstudy of oncolytic herpes simplex virus NV1020 in patients with extensively pretreated refractory colorectal cancer metastatic to the liver［J］．Hum Gene Ther，2010，21（9）：1119－1128．

［24］Du W， Ma XL， Zhao C， et al．Associations of single nucleotide poly⁃morphisms in miR⁃146a， miR⁃196a， miR⁃149 and miR⁃499 with colorectal cancer susceptibility［J］．Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（2）：1047－1055．

［25］Orang AV，Safaralizadeh R，Hosseinpour Feizi MA．Insights into the diverse roles of miR⁃205 in human cancers［J］．Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（2）：577－583．

［26］Castanotto D， Stein CA．Antisense oligonucleotides in cancer［J］．Curr Opin Oncol，2014，26（6）：584－589．

［27］Green DW， Roh H， Pippin JA， et al．Beta⁃catenin antisense treat⁃ment decreases beta⁃catenin expressin and tumor growth rate in colon carcinoma xenografts［J］．J Surg Res，2001，101（1）：16－20．

［28］Najar AG， Pashaei⁃Asl R， OMIDI Y， et al．EGFR antisense oligonu⁃cleotides encapsulated with nanoparticles decrease EGFR，MAPK1 and STAT5 expression in a human colon cancer cell line［J］．Asian Pac J Cancer Prev，2013，14（1）：495－498．

［29］Castel SE， Martienssen RA．RNA interference in the nucleus：roles for small RNAs in transcription， epigenetics and beyond［J］．Nat Rev Genet，2013，14（2）：100－112．

［30］Masiero M， Nardo G， Indraccolo S， et al．RNA interference：impli⁃cations for cancer treatment［J］．Mol Aspects Med，2007，28（1）：143－166．

［31］Liu M， Lang N， Chen X， et al．miR⁃185 targets RhoA and Cdc42 expression and inhibits the proliferation potential of human colorectal cells［J］．Cancer Lett，2011，301（2）：151－160．

［32］Mudduluru G， Ceppi P， Kumarswamy R， et al．Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR⁃34a and miR⁃199a／b in solid cancer［J］．Oncogene，2011，30（25）：2888－2899．

［33］Orang AV， Barzegari A．MicroRNAs in colorectal cancer：from diag⁃nosis to targeted therapy［J］．Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（17）：6989－6999．

《Cancer Translational Medicine》约稿函

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Progress of gene therapy for colorectal cancer

GAO Zhao⁃Ya， WANG Yan⁃Zhao， LEI Fu⁃Ming
Department ofGastrointestinalSurgery， Shougang Hospital，Peking University， Beijing 100144， China

Colorectal cancer（CRC） is one of the most commonly diagnosed cancers in human，posing a serious demographic and economic burden worldwide．Gene therapy involves the use of nucleic acids（DNA or RNA） for the treatment or prevention of human disorders．In recent years， gene therapy for colorectal cancer has attracted much attention，and many research results have been applied in clinic．Currently， the main methods for treating colorectal cancer include immunogene therapy， suicide therapy，gene correction therapy and oncolytic therapy．This article provides a summary of the progress of gene therapy for colorectal cancer．

colorectal cancer； gene therapy； oncogenes； virus vector

R735．3＋7

A

2095⁃6894（2017）09⁃55⁃04

2017－04－27；接受日期：2017－05－10

首都临床特色应用研究（Z161100000516003）

高兆亚．硕士．研究方向：结直肠癌肿瘤．

E⁃mail：gzy2082＠ 126．com

雷福明．副教授，主任医师．研究方向：普通外科．

E⁃mail：leifuming＠ 126．com