谷胱甘肽的高效液相色谱及色谱联用检测方法进展*

徐莹莹 王燕一

谷胱甘肽的高效液相色谱及色谱联用检测方法进展*

徐莹莹 王燕一

谷胱甘肽(glutathione，GSH)是一种含有巯基的三肽化合物。机体内谷胱甘肽主要以还原型的状态存在，氧化应激后形成氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)，后者在谷胱甘肽还原酶的作用下再形成还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)。还原型谷胱甘肽具有保护细胞免遭氧化损伤的重要作用。几乎所有哺乳动物体内都有谷胱甘肽。研究机体内还原型谷胱甘肽以及氧化型谷胱甘肽的含量，可以评价机体的氧化应激情况和疾病发生的风险。虽然很多学者都对体内的氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽进行了检测，但是检测结果差异较大。这是由于GSH发生自氧化从而造成GSH的低估，及GSSG的高估和(或)GSH／GSSG的低估。本文主要对GSH的色谱以及色谱联用例如：液质联用(liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS)等方法进行综述。

谷胱甘肽；色谱法, 高效液相

谷胱甘肽于1921年由学者Hopkins FG命名为“Glutathione”[1]。从结构上看，谷胱甘肽是一个由谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸组成的三肽化合物。在谷氨酸的侧链的羧基组和半胱氨酸的氨基组之间以肽键相连[2]。谷胱甘肽有两个特征结构:谷酰基链和巯基(-SH)组。这些结构促进其参与多种生理功能。机体内谷胱甘肽以两种形式存在,即GSH和GSSG。GSH－GSSH是真核细胞中重要的氧化还原缓冲配对。在维持细胞内环境稳态中起基础性作用。对GSH－GSSH定性或定量分析都是反应机体氧化损伤的重要指标。

1.谷胱甘肽概述

1.1谷胱甘肽的临床意义 GSH是一种重要的抗氧化剂，抗氧化体统功能减弱时，活性氧和活性氮对组织造成不同程度损伤，导致一些慢性疾病发生，Dalle－Donne等对此作了系统的综述[3]。谷胱甘肽能够保护红细胞膜上蛋白质的巯基处于还原状态,防止溶血,还可以持续其正常发挥运输氧的能力;能够与进入机体的有毒化合物(如:丙烯腈、 氟化物、一氧化碳)、重金属离子等直接结合,将其转化为无害的物质并排泄出体外,起到中和解毒的作用。GSH与睡眠相关[4]。GSH对神经元兴奋性中毒也有缓解作用;可以用于缓解恶性肿瘤患者化疗所致的毒副反应;治疗白内障及控制角膜和视网膜等眼部疾病;治疗糖尿病神经病变、糖尿病脂肪肝等并发症;抑制乙醇侵害肝脏产生脂肪,减轻病毒性肝炎、肝炎肝硬化以及药物性肝损伤症状;谷胱甘肽还具有抗艾滋病病毒的功效。唾液、尿液、全血、血浆、脑体液等体液中谷胱甘肽的含量都具有重要的临床意义[5]。

1.2谷胱甘肽的代谢反应 GSH可在谷胱甘肽过氧化酶的作用下转化为GSSG，同时在谷胱甘肽还原酶与还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的共同作用下再生成GSH[6][7]。生理上GSH和NADPH的作用下使得GSSG：GSH的比值为持在1：1000到1:100的范围内[8]。机体氧化应激水平增加或者谷胱甘肽还原酶的活性受限(例如6－磷酸葡萄糖脱氢酶的缺乏导致NADPH合成受限)时，导致GSSG、GSSG/GSH增加。大量的GSSG参与细胞内、外的代谢而消耗。细胞内的GSSG转化为GSH[9]。GSH由细胞内移向细胞外与肝脏和其他组织一起参与各器官之间的代谢反应[10]。

GSH与内源性集团发生反应，生成具有生物活性的内源性谷胱甘肽加合物[9,11]。虽然有些加合物可直接生成，但谷胱甘肽－S－转移酶GST介导的反应通常占主导地位。GSH的活性部位是半胱氨酸的巯基。高亲和性的巯基使GSH在生理条件发挥清除自由基的作用[12]。GSH与谷胱甘肽过氧化酶共同作用分解过氧化氢和有机过氧化物[2]。GSH有助于机体其他抗氧化剂的生成，例如维生素E、维生素C等。

GSH通过名为谷胱甘肽化(S-Glutathionylation)的途径与蛋白质的半胱氨酸残基结合。谷胱甘肽化可以被逆转，这一反应在细胞信号调节机制中也有重要作用[8,13]。谷胱甘肽化在氧化应激下有保护不稳定巯醇的作用；通过此过程储存GSH，以防止在氧化应激时GSH的减少。已有文献报道谷胱甘肽化反应异常可能与糖尿病、心血管疾病、肺部疾病、癌症、神经退行性疾病的发生相关[14]。

2.GSH和GSSG的测定分析

从20世纪50年代起,研究者就开始建立谷胱甘肽的各种测定方法,至今仍然有很多改进方法和新颖技术方案不断涌现。随着分析技术的不断进步,在检测技术的精确度、准确度、灵敏度和速度等方面都有明显提高。纵观谷胱甘肽的测定方法,形式多样,原理也不尽相同。可见分光光度法、酶法、荧光分光光度法、高效液相色谱法等是最主要和常用的方法,其它如差热扫描(DSC)、红外检测等方法虽然不常用,但是在研究工作中也有一定价值。从上世纪70年代 起,高效液相色谱法法和以上几种方法结合进行测定就开始被报道,此后出现了HPLC-UV、HPLC-ECD(high performance liquid chromatography-electrochemical detection)、HPLC－ OPA、HPLC－ GR、HPLC－ MS、LC－MS/MS等一系列方法。这些测定方法主要原理是以HPLC为分离手段，以质谱或其它检测方法为鉴定和测定手段联合使用检测化合物。本文主要对高效液相色谱法(high performance liquid chromatography;HPLC)、LC－MS等相关方法进行综述。高效液相色谱法具有分离效率高、选择性好、分析速度快、检测灵敏度高、操作自动化和应用范围广的特点。对于谷胱甘肽而言还具有可同时检测出GSH和GSSG的优点。

样品中GSH的准确测量较为困难,这是由于固体状态下的GSH较为稳定，液体样品中的GSH易被氧化为GSSG。GSH与GSSH间存在着氧化还原间的动态平衡。准确测量样品中的GSH和GSSG，避免因GSH被氧化造成的GSSG高估，及GSSG被还原造成的GSSG低估,至关重要。此外GSH的其它存在形式如GSSX、PROSSG等也会影响到检测的准确性。通过研究机体内GSH以及GSSG的含量以及他们的关系对于评价GSH－GSSG氧化还原系统的功能意义重大。因而准确测量样品中GSH、GSSG成为目前的研究热点之一。

2.1色谱柱以及流动相的选择 未被衍生化的GSH和GSSG是高极性化合物，研究表明GSH可选用极性高的色谱柱进行分离[17]。Dustin Carroll 选用了Luna PFP-2反相色谱柱柱(Phenomenex)，获得了较好的保留[16]。Isabella Squellerio等[17]学者选用了两种方法对GSH进行检测，一种采用高效液相色谱法和电化学技术联合(HPLC－ECD)检测，选用Synergy Hydro-RP(150mm×4.6mm，5m)色谱柱，流动相为含1%乙腈的20mM磷酸钾缓冲液(正磷酸调整pH值至2.7)。另一种采用液质联用(LCMS／MS)技术，选用Luna PFP(2)(100mm×2.0mm，3m)色谱柱，质谱流动相A相为0.75mM的甲酸铵(甲酸调节PH值至3.5)，B相为甲醇。两者比较Isabella Squellerio认为GSH的检测，LC－MS相对于HPLC－ECD具有更高的选择性,精密度、准确度和灵敏度，检测的稳定性也更好。Sophie Robin[18]等 使 用 MODULO CART QS KROMASIL 5C18 (INTERCHIM，France)(250mm×2mm×5m)色谱柱，流动相为含0.1%加酸的乙腈／水(50/50, v/v)。 也 有学者[19]采用Hypercarb的(Thermo Scientific，2.1mm×50mm×5m)色谱柱，流动相A相为含0.1%甲酸的水，B相为0.1%的乙腈，获得了较准确的测定结果。在以往的液相色谱检测GSH过程中较常用的是反相C18色谱柱，然而认为这种色谱柱对极性高的化合物(GSH)保留较低。Yusuke Iwasaki[22]采用了一款更适合检测高级性化合物的色 谱 柱，HILIC(150mm×2.1mm;Waters, Japan)色谱柱，流动相A相为0.5mM甲酸胺缓冲液(pH 4.0)，B相为乙腈，这款色谱柱更容易分离高极性化合物。

2.2内标的选择 由于基质效应以及其他多方面因素的影响，应选用与化合物性质较为相似的同位素内标[19]，如GSH(GSH 13C2,15N)、GSSG(GSSG 13C4,15N2)[20]。但同位素内标具有价格昂贵、不易获得等缺点。谷胱甘肽乙酯[21],巯基苯甲酸[15]，谷酰基谷氨酸[22]，阿昔洛韦等[23]也可作为内标使用。

2.3样品预处理 GSH样品预处理过程中最为关键的是防治其发生氧化。当PH＞7时，GSH易发生非酶促的氧化反应，酶促的GSH转化的中介是γ －谷酰基转肽酶，在中性PH值时其表现出最佳活力。因而建议将PH控制在酸性范围内。Rossi 和Caussé[24-26]已经对此进行了论证。此外GSH可以与蛋白质结合，形成结合物glutathionylated protein。在样品处理中加入含三丁基磷的二甲基甲酰胺10%(V/V)能有效的将其分离[5]。在测量全血、红细胞[25]和血浆以及尿液[26]中GSSG时应避免由于GSH氧化所造成的GSSG的高估。为了准确测量GSH以及GSSG，样品收集、防止氧化、沉蛋白以及对巯基的衍生化反应等意义重大。

2.3.1样品收集 样品收集过程对检测结果的准确性至关重要，在全血和血浆中红细胞溶血和储存温度等因素都对GSH和GSSG化验的结果造成潜在影响。样品收集后应尽早冷藏，以减少由于样品发生自氧化以及蛋白质水解对检测结果准确性的干扰[27]。在抽血过程中防止发生溶血以及控制储存温度对样品的准确测量非常重要，血浆收集后建议尽早离心分离[26,27]。溶血的血浆中GSH的易被高估，这是由于红细胞中的GSH约为血浆中GSH的500倍。另外，建议采用EDTA抗凝的血液采集管。EDTA不但有抗凝的功能还具有络合金属离子(例如Fe2+)的功能，因而可以防止氧化反应的发生[26,27]。diethylenetriaminopentaacetic acid(DETAPAC)也可作为非常重要的铁离子螯合剂[28]。

2.3.2.防止 发 生 氧 化 GSH易 被 氧 化 成GSSH。然而衍生化试剂N-乙基马来酰亚胺(N-ethylmaleimide，NEM)[29,30]，碘乙酸(iodoacetic acid，IAA)的加入使其转化为较为稳定的衍生物将有效的避免这一现象。衍生化试剂的选择对实验分析的结果有很大影响。二硫赤藓糖醇，二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、等巯基还原剂的使用都给GSH检测结果带来负面影响，这是由于他们与一些荧光试剂发生了竞争反应。MBB和邻苯二醛会导致荧光化合物干扰物的形成。

钠和硼氢化钾都是高效的还原剂，但是他们在水溶液中不稳定[31]。高浓度的还原剂发生还原反应仅需几分钟，但是低浓度时(40-100mM)需要30分钟以上或者加热的条件下才能完成。反应过程中形成的气体或气泡可通过加入单磷酸(monophosphoric acid，MPA)或表面活性剂来去除,如辛醇[32]。连二亚硫酸盐(DT,连二硫酸钠)也被用于二硫化合物的还原剂。

2.3.3除蛋白 蛋白质广泛存在于生物样品中，然而它们的存在不但为化合物检测带来不同程度干扰，还会堵塞色谱柱、降低仪器的使用寿命等。因此，在多数情况下蛋白质应在样品检测之前去除。只有少数方法(例如核磁共振)适用于检测完整细胞或应用于非脱去蛋白质的样品。酸化、有机溶剂,如乙腈、丙酮或甲醇,超滤等都可用于去除蛋白质。常用的酸性除蛋白试剂是5-磺基水杨酸(5-sulfosalicylic acid，5-SSA),三 氯 乙 酸 (trichloroacetic acid，TCA),三 氟 乙 酸(rifluoroacetic acid，TFA),高 氯酸(perchloric acid PCA)等[33,34]。相关报道提出终浓度为15%的PCA效果最佳[34]。

Caussé等[26]学者建立了用5-磺基水杨酸(5-SSA)或者乙腈(ACN)沉蛋白结合以6-iodoacetamidofluorescein (6-IAF)为衍生化试剂检测GSH的方法。然而在酸性环境下使用有机溶剂沉蛋白，如未对巯基进行保护将无法避免GSH发生氧化反应。Rossi等[25]学者发现将溶液的酸性环境调节至中性或者碱性PH值后，如果没有预先对巯基进行保护也会使巯基的浓度迅速降低。因而沉蛋白前保持巯基的稳定性至关重要。

此外，应用过滤的方法限制大分子的物质的滤过，也是一种有效去除蛋白质的方法[35-36]。这种方法的优点是不需要加入影响分离、衍生化、检测的酸和有机溶剂。大多数蛋白还可以应用膜滤法结合微浓度离心的方法去除[37]。Yusuke Iwasaki等[22]通过固相萃取(Solid-phase extraction，SPE)的方法去除唾液中的蛋白获得较好的效果。

2.3.4 GSH的衍生化 GSH有三个衍生化的位点,分别是羧基、氨基和硫醇,但首选发生衍生化的位点是硫醇。相比之下,GSSG能进行衍生化的位点只有两个，分别是氨基和羧基组。

最常用的衍生化反应化合物是NEM[30,38],IAA[39]和碘乙酰胺(IA)[40]。5，5’二硫硝基苯甲酸(5,5 ′ -dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB)也是一种检测GSH和GSSG的衍生化试剂[21,41,42]。NEM可与与巯醇发生偶联反应，常被用于荧光检测与质谱联用来测定GSSG[15,43-45]。但IA发生衍生化反应的同时，也产生了一些干扰物质。由于NEM对谷胱甘肽还原酶(GR)的抑制作用，应用NEM与谷胱甘肽还原酶的偶联反应发生较为困难。同时需注意的是当PH大于7.5时NEM会与氨基发生反应，虽然相比较巯基来说此反应发生的较少[24]。因此当反应在碱性条件下，或者使用了氨基的衍生化试剂例如FDNB时，反应后多余的NEM应在变成碱性化媒介之前去除。已有学者证实只有在酸化前加入NEM才可以防止巯基组氧化，否则会造成GSH的低估，以及GSSG的高估。但Tereza Moore[19]建立了同时加入NEM和SSA的一步反应，也获得了较好的结果。

3.结语

GSH作为细胞的一种抗氧化剂,参与多种重要的生理过程,可保护细胞免遭氧化损伤,解除药物代谢产物的毒性,调节基因表达和细胞凋亡,并与物质的跨膜转运相关。GSH参加抗氧化酶的酶促反应,具有协调内源性与外源性抗氧化剂的作用。同时GSH维持自由基的产生与清除的动态平衡,并使内环境处于稳定的还原态。GSH对维持机体健康以及疾病发生有预防和治疗的作用。在GSH测定过程中，最为重要的是维持样品中GSH的稳定，防止氧化。目前，对于维持其稳定并且准确测定已有较为全面的研究，但存在操作繁琐、重复性差、以及样品处理方法说法不一等问题。准确对机体GSH进行定量及定性分析，并对其状态做出正确评价具有重要临床意义，其方法学还需继续改进。

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Application of HPLC and hyphenated chromatograph on Glutathione measurement

XU Ying-ying, WANG Yan-yi.
(Department of Stomatology, the Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)

Glutathione (GSH) is a thiol-containing tripeptide. Free glutathione is present mainly in its reduced form, which can be converted to the oxidized glutathione (GSSG) during oxidative stress, and can be reverted to the reduced form by the action of the enzyme glutathione reductase(GSH).Reduced glutathione plays an essential role in protecting cells from oxidative damage . Almost all mammals have glutathione in their bodies Measurement of GSH and GSSG is a useful indicator of oxidative stress and disease risk. As a possible marker of oxidative stress, many studies have measured GSH and GSSG. However, large differences in GSH and GSSG levels reported in different studies, calls for a reliable standardized method. This is due to the autoxidation of GSH resulting in an underestimation of GSH, and the overestimation of GSSG and (or) GSH / GSSG underestimation In this paper, we review determination GSH and GSSG with high performance liquid chromatography (HPLC)and hyphenated chromatography such as liquid chromatographmass spectrometer(LC-MS),et al.

Glutathione ; Chromatography, High Performance Liquid

R781

A< class="emphasis_bold">[文章编号]1

1672-2973(2017)01-0051-06

2016-08-10)

“十二五”国家高技术研究发展计划(863计划)(项目编号:2012AA020809)三亚市医疗卫生科技创新项目(项目编号:2014YW34)

徐莹莹 解放军总医院口腔科 硕士生 北京 100853

王燕一 通讯作者 解放军总医院海南分院口腔科 主任医师 副教授 海南 572013