2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌通过ROS/Akt通路诱导HepG2细胞凋亡

邱美玉，刘军，申贵男，崔玉东，韩英浩

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌通过ROS/Akt通路诱导HepG2细胞凋亡

邱美玉，刘军，申贵男，崔玉东，韩英浩

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

为研究修饰后的萘醌类衍生物对人肝癌细胞株HepG2诱导细胞凋亡作用及其机制。采用MTT、流式和Western blot方法观察2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌对人肝癌细胞的生长作用。结果表明：2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌可通过促进早期ROS水平升高，抑制Akt的磷酸化水平，并选择性地激活p38，ERK信号通路，从而抑制肝癌细胞株HepG2细胞的增殖并诱导其发生凋亡。

萘醌类衍生物；HepG2；增殖抑制；活性氧

原发性肝癌是全球最常见的癌症，有较高的死亡率[1-3]。过去20年间，肝癌患者的相对生存率仅由3%增长到4%～7%[4]，主要原因归结于肝癌的高复发性和没有有效的药物治疗，研究和应用有效的新药仍是未来长期的持续性工作[5]。《神农本草经》中曾记载紫草具有清热凉血、活血和解毒去疹的功效，用于血热毒盛、麻疹不透、疮疡、湿疹、水火烫伤等病害[6]。紫草萘醌类化合物是中草药紫草中的活性成分，因此，人们对萘醌类化合物抗肿瘤作用产生极大的兴趣，合成了大量萘醌衍生物，探讨他们的抗肿瘤活性、作用机理、构效关系，研究其抗氧化功能[7]，并通过实验证明开发紫草萘醌类化合物作为抗肿瘤药物也具有重要的意义[8]。紫草萘醌类化合物的5，8位羟基被认为是产生细胞毒性的关键基团，分析萘醌的化学结构可以看出，萘醌类化合物的活性主要来自于萘环部分羰基的亲电作用，但是由于α环的羟基和β环的羰基发生互变导致醌环亲电性的降低，使萘醌的抗癌活性大大降低。研究发现，α环的甲基化可以增加羰基的亲电性能，同时避免α环的羟基和β环的羰基互变，从而提升萘醌的抗癌活性。β环的羰基是萘醌类衍生物的特有活性基团，故此部分保持不变。利用亲核试剂对α，β-不饱和羰基进行攻击，通过迈克尔加成反应添加硫醇或氨基化合物给萘环的提供电子，并且通过2位的加成反应，将原来结构中的1-羟基-4-甲基戊-3-烯基改变为辛亚砜或辛胺基可以精确的比较不同的亲核基团对萘醌类化合物生物活性的影响。该实验重点对比了两种结构相似的萘醌类衍生物的活性，并且对生物活性较强的2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌抑制HepG2细胞增殖的分子机理进行阐述，旨在揭示不同亲核基团对萘醌类衍生物构效关系的影响并且明确其发挥抑制癌细胞增殖的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2肝癌细胞系购自江阴康众康民生物医药技术有限公司。

1.2 试剂及仪器

DMEM/高糖培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自索莱宝公司，抗p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-p38、p38、p53、Bcl-2、Bad、Cleavaged caspase3、αtubulin抗体购自美国Santa Cruz公司，细胞凋亡试剂盒购自碧云天公司，噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自Amresco公司，NC膜购自PALL公司，ECL购自Thermo公司，培养皿购自NEST公司。蛋白免疫印迹系统（Amersham Bioscience，美国）；多功能酶标仪（TECAN）；流式细胞仪（BD，FACS Calibur）。

1.3 化合物合成

1.3.1 5，8-二羟基-1，4-萘醌的合成

将无水三氯化铝（1.06 mol）与氯化钠（0.484 mol）的混合物加热至150～155℃搅拌熔融。慢慢加入1，4-二甲氧基苯（0.12 mol）与马来酸酐（0.24 mol）的混合物。加毕，迅速升温至170℃，保温5～10 min后逐渐冷却至室温，反应物逐渐凝固。加入1 400 mL水使其溶解，再加入100 mL浓盐酸，搅拌过夜，过滤后弃去废液，得滤渣，干燥后，用石油醚重结晶，得目标产物5，8-二羟基-1，4-萘醌。

1.3.2 5，8-二甲氧基-1，4-萘醌的合成

用25 mL邻二氯苯溶解萘茜（0.01 mol）、无水碳酸钠（0.05 mol）、对甲苯磺酸甲酯（0.04 mol），加热回流2 h，冷却后过滤，回收滤液，加入大量石油醚，析出橙棕色固体，过滤，回收固体，真空干燥，再利用石油醚重结晶，得到5，8-二甲氧基-1，4-萘醌。

1.3.3 2 -辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌的合成

将5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（1.38 mmol）溶于30 mL甲醇，加正辛硫醇（1.65 mmol），室温搅拌4 h，加入浓硫酸（0.23 mmol）、重铬酸钠（0.76 mmol），继续搅拌5 min，移至分液漏斗，加入30 mL饱和盐水，60 mL氯仿萃取两次，用无水硫酸钠脱水，浓缩干燥后，柱层析提纯得2-辛巯基-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌。

将上一步合成得到的2-辛巯基-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（0.2 mmol）溶于25 mL二氯甲烷。加入间氯过氧苯甲酸（0.22 mmol），0℃反应2 h，加入少量碳酸氢钠水溶液停止反应，移至分液漏斗，加入50 mL饱和盐水，用20 mL二氯甲烷提取两次，无水硫酸钠脱水，浓缩干燥后，柱层析提纯得目标产物2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌。

将5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（1.38 mmol）溶于30 mL甲醇、加正辛胺（2.07 mmol），室温搅拌4 h，反应混合物加入饱和盐水，二氯甲烷提取两次，浓缩干燥经柱层析提纯，得目标产物2-辛胺基-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌。

1.4 细胞传代培养

HepG2细胞培养在完全培养基（DMEM；Invitrogen），含有10%灭活的新生胎牛血清（FBS；Hyclone，Logan，UT，USA）和1%的抗生素（青霉素/链霉素）并置于37℃、5%CO2恒温培养箱中传代培养。

1.5 MTT检测细胞增殖抑制

取对数生长期的HepG2细胞，以200 mm-2接种于96孔细胞培养板中，培养24 h后，加入不同浓度两种化合物，处理24 h。每孔加入20 μL的MTT （5 mg·mL-1），继续培养4 h。弃去培养液后每孔加入100 μL DMSO溶液，吹打混匀，用酶标仪于570 nm波长处测吸光度值。每组实验均重复3次。

1.6 细胞凋亡及ROS水平检测

ROS的分析，用ROS的指示剂（1 mM，CM2-DCFDA）与处理过的HepG2细胞在 37℃孵育10 min后，用PBS洗3次，再用500 μL的PBS重悬，利用流式细胞仪分析10 000个细胞内所带的ROS指示剂的荧光强度。细胞凋亡检测严格按照说明书进行操作。

1.7 蛋白质免疫印迹分析

将处理后的细胞回收，加入蛋白质裂解液裂解，充分混匀，在12 000 r·min-1，4℃条件下离心20 min，提取细胞总蛋白并定量，用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶上进行凝胶电泳，分离20 μg总蛋白，电印迹转移法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（nitrocellulose membranes Millipore，USA），再用5%Skim milk封闭1 h，TBST（含15 mmol·L-1NaCl、0.2%Tween-20和10 mmol·L-1Tris-Hcl）洗涤5次，每次5 min，随后用一抗在室温下孵育1 h。再用TBST洗涤5次，每次5 min，与HRP标记的鼠或兔二抗（1:5 000）孵育2 h，洗膜5次，进行ECL化学反应发光显影及结果分析。

2 结果与分析

2.1萘醌类衍生物的鉴定

以上分析数据显示，获得的2种化合物均属于萘醌类衍生物，并且其化学结构和分子量符合预先的合成设计，保证了化合物的准确性。化合物结构与名称如图1所示。

图1 两种萘醌类衍生物的结构与名称Fig.1 The structures and names of two kinds of naphthoquinone derivatives

2.2 2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌和2-辛胺基-5，8-二甲氧基-1，4萘醌对HepG2细胞增殖抑制率比较

为了检测不同亲和基团的DMNQ衍生物对HepG2细胞的抑制效果，以1、3、5、10、20、40、60、80、100 μmol·L-1浓度的2种萘醌类化合物处理HepG2细胞24 h，通过MTT assay方法对HepG2细胞的增殖抑制作用进行检测（图2）。结果显示，2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌在3 μmol·L-1浓度下即可表现出抑制HepG2细胞增殖的效果，并且抑制作用呈浓度依赖性，而2-辛胺基-5，8-二甲氧基-1，4萘醌在1～100 μmol·L-1的浓度下均未显示出对HepG2细胞的增殖抑制作用。结果证明，添加不同亲和基团（辛亚砜与辛胺基）的萘醌类衍生物对HepG2细胞的增殖抑制作用有明显差异，辛亚砜的加入可保持较好的抑制HepG2细胞增殖的生物活性，而辛胺基的加入大幅降低了萘醌类衍生物对HepG2细胞的毒性。

2.3 2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌诱导HepG2细胞产生ROS和发生凋亡

2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌对HepG2细胞的增殖具有明显的抑制作用，为了更加明确这一现象发生的分子机理，我们通过10 μmol·L-12-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌处理0、3、6、12 h，检测细胞凋亡和ROS水平。结果显示，2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌在10 μmol·L-1浓度下处理3 h时会使细胞内ROS水平升高（图3B），分别处理3 h，6 h，12 h，细胞均会发生明显的凋亡现象并且呈现出时间依赖性（图3A）。

图2 两种萘醌类衍生物对HepG2增殖抑制作用的影响Fig.2 Effect of two kinds of naphthoquinone derivatives on HepG2 cell viability

图3 2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌抑制HepG2细胞凋亡和胞内ROS水平升高Fig.3 2-（octane-1-sulfinyl）-5，8-dimethoxy-1，4-naphthoquinone induce apoptosis and elevate intracellular ROS level of HepG2 cell

2.4 2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌对HepG2细胞凋亡，MAPKs，Akt信号通路的影响

MAPKs家族，是将细胞表面信号转导至细胞核的重要传递者。该家族通过影响哺乳动物内基因的转录和调控，从而影响细胞的生物学反应（如增殖、分化、转化以及凋亡等）[9]。随着对细胞凋亡相关基因改变及其凋亡信号传导路径的进一步研究，发现MAPKs途径在诱导细胞凋亡的过程中发挥了极为重要的作用[10]；PI3K/Akt信号通路在外界刺激引发的级联反应中起着关键作用，Akt处于许多线粒体介导细胞凋亡通路的交汇点，可以通过磷酸化或与细胞死亡因子相互作用直接或间接调节细胞凋亡[11]。因此，为了检测2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌诱导HepG2细胞凋亡发生的机制，对Akt及MAPKs信号通路进行了检测。在10 μmol·L-12-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌处理0 h、3 h、6 h、12 h后，检测HepG2细胞的凋亡信号关键蛋白，MAPKs信号通路关键蛋白以及Akt的活化程度（图4）。结果显示，凋亡相关蛋白Cleavaged caspase3随着时间延长逐渐升高，抗凋亡蛋白Bcl-2减少，促凋亡蛋白Bad增加，抑癌基因P53表达量升高（图4A）。MAPKs家族成员p38，ERK的磷酸化水平都随处理时间的延长而增加，JNK的磷酸化水平无明显变化（图4B）。与细胞生存密切相关的Akt的磷酸化水平随药物处理时间的增加而明显降低（图4C）。结果显示，2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌可以激活MAPKs信号通路，降低Akt的磷酸化水平。

3 讨论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率高，预后差。尽管肝癌的手术治疗与局部治疗近年来取得了一定的进步，但大多数肝癌患者在确诊时已失去手术机会，药物治疗对于肝癌仍然不可或缺[5]。目前，大多数药物的疗效都难尽人意，因此新药开发是突破肝癌治疗瓶颈的重要策略。癌症的开始和发展过程中都伴随着凋亡减少和增殖能力的增加，因此，诱导癌症细胞凋亡是治疗癌症的重要策略之一。紫草萘醌类化合物具有抗肿瘤活性，对紫草萘醌类化合物进行结构修饰及构效关系分析是新药开发的重要内容。紫草萘醌类化合物的5，8位羟基被认为是产生细胞毒性的关键基团，将萘醌的5，8位经过甲基化由紫草素的羟基改为甲氧基，可降低其细胞毒性，且通过2位的加成反应，将原来结构中的1-羟基-4-甲基戊-3-烯基替换为辛亚砜或辛胺基可以比较不同的亲和基团对萘醌类化合物生物活性的影响。

图4 2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌对HepG2细胞p53、MAPKs和细胞周期蛋白的影响Fig.4 Effect of 2-（octane-1-sulfinyl）-5，8-dimethoxy-1，4-naphthoquinone on apopotosis associated proteins，MAPKs signaling pathways and Akt signaling pathway

细胞凋亡在肿瘤发生发展和抗肿瘤药物治疗中都扮演着重要角色[12]。有文献指出，紫草素能够通过ROS/Akt和PIPI/NF-KappaB信号通路诱导肝细胞发生凋亡[8]。结果表明，辛亚砜基团的添加保留了萘醌类化合物的活性，而辛胺基的添加使其丧失诱导癌细胞凋亡的能力。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白，例如Bad，Bak，Bad，Bcl-Xs，Bid，Bik，Bim和 Bcl-2，BclxL，Bcl-W，Bfl-1和Mcl-1等抗凋亡蛋白[13-15]。活化的PI3K产生3，4，5-三磷酸盐磷脂酰肌醇，它能够招募PDK和Akt丝氨酸，苏氨酸激酶到细胞膜上，导致Akt的磷酸化，Akt的磷酸化是和细胞生存紧密相关的；Bad是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，Akt可以使Bad的136位丝氨酸发生磷酸化，从而使Bad与Bcl-2/Bcl-X复合体分离，失去促凋亡功能；p53为抑癌基因，它通过引起细胞周期阻滞和细胞凋亡来维持细胞基因组的稳定性，在防止肿瘤的发生发展中扮演重要角色。正常情况下，细胞中p53表达较少，当DNA损伤时会引起p53蛋白表达量和活性的提高。有研究证明p53是通过激活它的下游途径调控凋亡的[16]，大量的Bcl-2蛋白和线粒体腺苷酸蛋白在依赖p53的细胞凋亡中受影响[17]。MAPKs信号转导途径在人体中广泛存在，各种神经递质、生长因子、炎症因子、促分裂素、神经营养因子等细胞外刺激信号均可以通过MAPKs信号转导通路参与细胞增殖、分化、发育、凋亡以及炎症的生理病理过程[12]。有研究表明，萘醌类化合物可以通过MAPKs家族成员的激活介导肿瘤细胞的凋亡。

结果表明，与2-辛胺基-5，8-二甲氧基-1，4萘醌相比，2-辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌具有更好的活性，它通过调节胞内ROS的产生，激活p38，ERK，抑制Akt的磷酸化，从而促进细胞凋亡。

综上所述，与2-辛胺基-5，8-二甲氧基-1，4萘醌相比，辛亚砜-5，8-二甲氧基-1，4萘醌可以有效地抑制HepG2增殖，这种抑制作用是通过ROS/Akt和MAPKs信号通路来完成的。研究结果为紫草萘醌类衍生物的进一步研究与开发提供了实验数据和理论依据。

参考文献：

［1］Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics ［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［2］Parkin D M，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics ［J］.CA Cancer J Clin，2005，55（2）：74-108.

［3］陈建国.中国肝癌发病趋势和一级预防［J］.临床肝胆病杂志，2012，28（4）：256-260.

［4］O'Brien K，Cokkinides V，Jemal A，et al.Cancer statistics for Hispanics，2003［J］.CA Cancer J Clin，2003，53（4）：208-226.

［5］贾晋斌，倪淑欣.肝癌治疗新药临床研究进展［J］.中国医药生物技术，2011，6（2）：131-133.

［6］黄河，刘宗潮.紫草素及其衍生物的抗肿瘤作用［J］.肿瘤防治杂志，2005，12（1）：75-78.

［7］王昊乾，孔令祖，申贵男，等.新型萘醌类衍生物对细胞衰老的抑制作用［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015，27（4）：72-76.

［8］Gong K，Li W，Shikonin，et al.Chinese plant-derived naphthoquinone，induces apoptosis in hepatocellular carcinoma cells through reactive oxygen species：A potential new treatment for hepatocellular carcinoma［J］.Free Radic Biol Med，2011，51（12）：2259-71.

［9］邱建武，郭薇，申丽娟.p38MAPK在肝细胞癌中的研究进展［J］.世界华人消化杂志，2008，16（5）：503-509.

［10］王文，任玲，王健楠.MAPK信号通路与细胞凋亡的关系［J］.中国实用医药，2010，5（15）：260-261.

［11］赵婧，屈艺，母得志.Akt与细胞线粒体凋亡途径［J］.生命的化学，2010，30（4）：528-532.

［12］Kuida K，Boucher D M.Functions of MAP kinases：insights from gene-targeting studies［J］.J Biochem，2004，135（6）：653-656.

［13］Kalimuthu S，Se-Kwon K.Cell survival and apoptosis signaling as therapeutic target for cancer：marine bioactive compounds［J］.Int J Mol Sci，2013，14（2）：2334-54.

［14］Reed J C，Miyashita T，Krajewski S，et al.Bcl-2 family proteins and the regulation of programmed cell death in leukemia and lymphoma［J］.Cancer Treat Res，1996，84：31-72.

［15］Yip K W，Reed J C.Bcl-2 family proteins and cancer［J］. Oncogene，2008，27（50）：6398-406.

［16］周桔，罗荣保，汤长发，等.Bcl-2蛋白家族和p53基因在细胞凋亡中的调控效应［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11（10）：1950-1952.

［17］Djebaili M，Rondouin G，Baille V，et al.p53 and Bax implication in NMDA induced-apoptosis in mouse hippocampus［J］.Neuroreport，2000，11（13）：2973-2976.

2-（octane-1-sulfinyl）-5，8-Dimethoxy-1，4-Naphthoquinone Induce HepG2 Apoptosis through ROS/Akt and MAPKs Pathway

Qiu Meiyu，Liu Jun，Shen Guinan，Cui Yudong，Han Yinghao
（College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

To investigate the effects of modified naphthoquinone derivatives on apoptosis in hepatocellular carcinoma HepG2 cells and its underlying mechanism.The effect of 2-（octane-1-sulfinyl）-5，8-Dimethoxy-1，4-Naphthoquinone on the growth of human hepatocellular carcinoma cells was observed by MTT，flow and Western blot method.The results showed that 2-（octane-1-sulfinyl）-5，8-Dimethoxy-1，4-Naphthoquinone could elevate ROS level，inhibit phosphorylation of Akt，selectively activate p38 and ERK signaling pathway，thus inhibite proliferation and induce apoptosis of HepG2 cell.

naphthoquinone derivatives；HepG2；proliferation inhibition；ROS

R285

A

1002-2090（2016）05-0081-06

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.016

2016-03-18

黑龙江八一农垦大学校科研启动计划项目（XYB2012-12）。

邱美玉（1990-），女，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院2013级硕士研究生。

崔玉东，男，教授，博士研究生导师，E-mail：cuiyudong@yahoo.com；韩英浩，男，副教授，E-mail:yinghaohan@byau.edu.cn。