鼻息肉组织核因子-κB和白细胞介素4的表达及意义

万贝贝，胡乐农，徐红伟

（浙江省丽水市中心医院，浙江丽水323000）

鼻息肉组织核因子-κB和白细胞介素4的表达及意义

万贝贝，胡乐农，徐红伟

（浙江省丽水市中心医院，浙江丽水323000）

目的探讨核因子-κB（NF-κB）和白细胞介素4（IL-4）mRNA在鼻息肉组织中的表达及意义。方法选取90例术后病检确诊为鼻息肉患者鼻腔新生物（不分侧别）作实验组，同期取80例因单纯鼻中隔偏曲而行下鼻甲部分切除的患者的下鼻甲组织（不分侧别）作为对照组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）结合半定量分析方法检测，比较两组NF-κB、IL-4的表达水平。结果NF-κB和IL-4在实验组表达水平高于对照组（P<0.05）。结论NF-κB和IL-4 mRNA表达水平与炎症相关，可能与鼻息肉的发病机制相关。

核因子-κB；白细胞介素4；鼻息肉

鼻息肉作为耳鼻喉科的常见病、多发病，会严重影响患者的鼻腔通气功能，致使患者生活质量严重下降。然而时至今日，国内外对于鼻息肉的确切发病机制仍不明确，多数观点认为其是多因素、多种基因、多信号途径参与的共同结果。鼻息肉组织的病理切片中以炎症改变为主，表现为上皮增生、细胞间质的高度水肿以及毛细血管增生等形态特征。核因子-κB（nuclear factor-κb，NF-κB）是一个近年来新发现的炎症信号诱导的核转录调控因子，国外最新研究发现鼻息肉上皮细胞中NF-κB的活性表达明显升高，而同时国内多位学者采用免疫组织化学方法研究也证实鼻息肉中NF-κB在鼻息肉组织的炎症细胞、上皮细胞、部分腺体及血管内皮细胞的细胞核及细胞浆内均表现为高表达，表明NF-κB在鼻息肉组织中过度活化，细胞因子转录增强，可能导致大量细胞因子的生成[1]，在鼻息肉的发生、发展中发挥着重要作用。白细胞介素4（lnterleukin 4，IL-4）作为Th2的自分泌细胞因子，是免疫系统中作用最强、范围最广的细胞因子，既能调节细胞免疫，又能调节体液免疫。它对Th2细胞的生长发育分化起着关键性作用，可使Th0直接转变为Th2，增强细胞免疫作用，在免疫细胞之间发挥多重免疫调节作用。有国内学者用免疫组织化学方法发现鼻息肉中IL-4的表达明显增高，同时亦有研究发现鼻息肉中IL-4的表达不稳定，在鼻息肉组织和正常鼻腔黏膜组织中表达差异无统计学意义[2]。而SOYKA[3]研究发现，IL-4会导致正常鼻腔黏膜上皮屏障的缺陷，可能与鼻息肉的发病有关联。本次研究希望通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术进一步探讨NF-κB和IL-4 mRNA在鼻息肉组织中的表达及其对于未来鼻息肉临床治疗中可能发挥的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料

1.1.1 实验标本选取2015年9月-2016年1月在丽水市中心医院行鼻息肉摘除术的90例鼻息肉患者的鼻息肉组织（术后病检为鼻息肉）作研究对象（实验组）。其中，男性51例，女性39例；年龄30～50岁。同期取80例患者因单纯鼻中隔偏曲需切除鼻甲组织作为对照组。其中，男性42例，女性38例；年龄33～54岁。所有患者术前至少停止使用抗生素类或激素类药物治疗4周以上。

1.1.2 主要试剂及设备PCR反应仪（德国Biometra公司），Trizol RNA试剂（美国Invitrogen公司），凝胶成像分析仪（美国Beckman公司），逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司）。引物合成交由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2 实验方法

1.2.1 提取总RNA法标本采集后装入无菌冻存管内，标记后将其放入-80℃冰箱冷冻保存。标本统一称量，每100mg鼻息肉组织加入1ml RNA分离液提取标本RNA，利用紫外分光光度计检测提取的RNA纯度。RNA的纯度可以通过计算测定260 nm/ 280 nm的紫外吸收值来评定。RNA纯度测定值需在1.9～2.0，这样的RNA可以用来进行后续实验。

1.2.2 逆转录RT体系配置及PCR反应逆转录（Real-time RT polymerase chain，RT）反应体系20μl由标本总RNA 8μl，随机引物2μl，5×逆转录反应缓冲液4μl，逆转录酶1μl，RNA酶抑制剂0.5μl，0.1mol/L二硫苏糖醇溶液1μl，脱氧核糖核苷三磷酸2μl，无RNA酶的双蒸水1.5μl混合配置而成。PCR反应体系20μl由正反向引物各1μl，Taq PCR mastermix 10μl，逆转录产物cDNA 1.5μl，双蒸水6.5μl配置而成。本实验中共有3对引物序列，NF-κB的引物序列正向：5'-CTTTTCGACTAC GCGGTGA-3'，反向：5'-GGCAGCTAGGTGCAAAAC A-3'，扩增片段长度为390 bp。IL-4的引物序列正向：5'-CAGTTCTACAGCCACCATGAGA-3'，反向：5'-CATGATCGTCTTTAGCCTTTCC-3'，扩增片段长度为188 bp。β-actin看家基因的引物序列正向：5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3'，反向：5'-TCCCT CTCAGCTGTGGTGGTGAA-3'，扩增片段长度为590 bp。NF-κB的PCR反应程序设定为95℃预变性5min，然后按下列设定程序进行循环：94℃加热15 s，59℃退火40 s，72℃延伸45 s，34个循环后于72℃再延伸10min。IL-4的PCR反应程序设定为95℃预变性5min，然后按下列设定程序进行循环：先94℃进行加热15 s，然后设定63℃退火30 s，之后72℃延伸45 s，反复进行35个循环后再于72℃延伸10min后结束反应。

1.2.3 检测方法采用RT-PCR反应将提取的标本RNA在一定反应条件下逆转录为cDNA。RTPCR反应按照说明书进行操作。PCR反应后，取9 μlMarker及9μl产物在琼脂糖凝胶上持续电泳30min，分离PCR产物，凝胶成像仪上可清晰看见目的基因及看家基因的DNA扩增片段条带。NF-κB的扩增片段条带位于390 bp、IL-4的扩增片段条带位于188 bp、看家基因β-actin的扩增片段条带位于590 bp。用仪器自带分析软件以NF-κB扩增条带吸收度值（DNF-κB）与内对照β-actin扩增条带吸收度值（Dact）的比值（DNF-κB/Dact）为NF-κB mRNA的表达水平，同样以DIL-4/Dact为IL-4的mRNA的表达水平。逐个计算标本的光密度比值后，对NF-κB、IL-4的相对表达水平进行半定量数值统计分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组资料间的均数比较用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

RNA琼脂糖电泳显示，28 s rRNA和18 s rRNA条带明亮清晰，且第1条带（28 s）亮度为第2条（18 s）亮度的大约2倍，显示提取的标本mRNA质量较好，可以继续进行后面的实验（见图1）。实验组及对照组NF-κB、IL-4的mRNA均可见表达，且其在实验组中的表达量高于其在对照组中的表达（P<0.05），见图2、3和附表。

图1 总RNA电泳鉴定图

图2 NF-κB的RT-PCR电泳图

图3 IL-4的RT-PCR电泳图

附表 实验组与对照组NF-κB、IL-4的m RNA表达量（±s）

附表 实验组与对照组NF-κB、IL-4的m RNA表达量（±s）

组别NF-κB IL-4实验组（n=90）1.093±0.263 0.852±0.238对照组（n=80）0.635±0.149 0.546±0.123t值10.027 7.476P值0.007 0.003

3 讨论

本研究采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR反应）方法从基因水平来检测NF-κB和IL-4的表达，更加准确地表明，NF-κB和IL-4在实验组中的表达均高于对照组，其在鼻息肉的病理生理过程中可能发挥着极其重要的作用。

NF-κB是近年来发现的一组具有多种生物学效应的炎性转录因子，人类最初发现其可以调控B免疫球蛋白的k轻链而将其命名为NF-κB。研究发现，NF-κB多以同源或异源二聚体P65和P50的形式与抑制蛋白家族成员形成复合体存在于人体组织细胞中。从近几年的研究来看，NF-κB在许多领域倍受关注，其在机体的免疫反应、炎症反应、应激诱导反应、细胞的增殖与凋亡中都发挥着极其重要的作用[4]。NF-κB经典途径活化后基因主要编码MCP-1、IL-8等趋化因子，IL-4、IL-5、粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）等炎症细胞因子，其中众多的炎症细胞因子如IL-4和TNF-α又可继续活化NF-κB信号通路，诱发更多的炎症细胞因子表达水平上调，导致最初炎症信号进一步放大，形成“瀑布效应”，这是NF-κB的正反馈调节，同时也是NF-κB反应灵敏并迅速增加的重要机制[5]。有最新研究表明，NF-κB mRNA主要表达分布与鼻息肉组织的嗜酸性粒细胞、上皮细胞、部分腺细胞、浆细胞及血管内皮细胞的细胞核和细胞浆中。提示NF-κB与鼻息肉的关系密切，可以通过抑制NF-κB的传导同路来抑制炎症细胞的分泌[6-7]。

IL-4是由抗原或丝裂原刺激B细胞、T细胞（Th2）产生的自分泌细胞因子，它可活化肥大细胞及各种粒细胞，与IL-5协同可刺激B细胞增殖并合成IgE及IgG1，国外有研究表明，在鼻息肉组织中的IgE水平与IL-4水平呈正相关。在正常人体中Th1和Th2细胞处于相对平衡趋势，机体存在多种保持Th1/Th2平衡的调节机制。其中认为IL-4、IFN-γ的相互调节是维持Th1/Th2平衡的关键因素[8]。Th1/Th2的平衡失调，Th2细胞因子表达占据主导可能与鼻息肉的发生发展关系密切，而IL-4在Th2细胞因子产生和释放中发挥极其重大的作用[9-10]。NF-κB是介导细胞内信号传递最重要的核转录因子，NF-κB与Th细胞分化的关系的研究目前尚处于起步阶段。有研究发现，NF-κB参与Th1淋巴细胞免疫反应的调节过程，但也有学者认为NF-κB通过对淋巴细胞中IL-4基因转录的调控，使机体免疫反应向Th2淋巴细胞介导的体液免疫发展[11-12]。

本实验RT-PCR结果表明，NF-κB和IL-4在鼻息肉组织中基因表达水平高于正常鼻甲组织，两者可能在鼻息肉的发病机制中起着至关重要的作用。当机体受到外界病源微生物的刺激时，NF-κB和IL-4的表达量骤然增加，导致嗜酸性粒细胞的聚集，继发加剧机体内Th2引发的炎症反应，由Th2诱发的炎症反应在机体内不断加剧，并不断刺激NF-κB和IL-4的进一步产生和释放。Th2所诱导的炎症反应不仅可双重刺激体内IL-4的产生，与此同时也不断促使大量其他的炎症因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、IL-5、IL-8、IL-17、和TNF-α等，这些不同的炎症因子与IL-4相互协同，使机体逐步失去了Th1/Th2的平衡。NF-κB和IL-4均参与鼻息肉的发病过程，研究表明，机体局部微环境的破坏可进一步诱发机体Th1/Th2的失衡，上述两个方面相互作用，对鼻息肉的发病起着非常重要的作用。继续深入研究NF-κB和IL-4的表达及其与鼻息肉的发病关联，可以在今后鼻息肉的临床预防、后期诊断及用药治疗上提供充足的理论依据和参考指标。

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（张蕾编辑）

Expression and significance of NF-κB/IL-4 gene in nasal polyp

Bei-beiWan,Le-nong Hu,Hong-wei Xu
(Lishui Central Hospital,Lishui,Zhejiang 323000,China)

ObjectiveTo investigate the different expression of nuclear factor-κb and lnterleukin 4(IL-4)gene in tissue of the nasal polyp.MethodsA number of 90 cases of nasal polyp were collected as experimental group and 80 cases inferior turbinate tissues as normal group.Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)method was used to detect the different expression of NF-κB and IL-4 gene,and relative analysiswas used to analyzed the results.ResultsCompared with normal group,the expression of NF-κB and IL-4 gene in expermental group was significantly increased(P＜0.05).ConclusionsThe expressions of NF-κB and IL-4 are increased in experimental group,whichmay relatewith the occurrence and developmentof nasal ployp.

NF-κB;IL-4;nasal polyp

R 765

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.009

1005-8982（2016）24-0043-04

2016-04-08