超声波萃取-PSA净化-气相色谱法测定水产品中氯霉素

胡红美，郭远明，孙秀梅，朱敬萍，尤炬炬，何依娜，顾蓓乔

（浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021）

超声波萃取-PSA净化-气相色谱法测定水产品中氯霉素

胡红美，郭远明，孙秀梅，朱敬萍，尤炬炬，何依娜，顾蓓乔

（浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316021）

建立了测定水产品中氯霉素的气相色谱电子捕获检测方法(GC-ECD)。样品通过乙酸乙酯超声波萃取，正己烷初步净化后，经过适量的N-丙基乙二胺（PSA）固相吸附剂进一步净化，硅烷化试剂衍生，再采用GC-ECD法检测，外标法定量。结果表明，氯霉素在1.5～100 μg/L浓度范围内，组分含量与峰面积呈线性相关，相关系数分别为0.9996，检出限为0.1 μg·kg-1。氯霉素在不同基质的水产品（鳗鲡、鳜鱼、大管鞭虾）中不同浓度水平的加标回收率分别为92%～103%、86%～108%和78%～99%，相应的相对标准偏差（RSDs）分别为3.5%～4.2%、3.1%～4.6%和2.6%～3.9%（n=5）。本方法简单快速，基体干扰小，线性范围宽，灵敏度、准确度、精密度能满足水产品中氯霉素的含量分析。

超声波萃取；N-丙基乙二胺；气相色谱电子捕获检测法；水产品；氯霉素

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种广谱抗菌药，因其具有抑菌性和杀菌性被广泛用于水产养殖过程中细菌性疾病的预防和治疗。氯霉素因其苯环上有硝基，故对人体有严重的副作用，会抑制骨髓造血功能，引起再生障碍性贫血[1]。约1/3 000的人对氯霉素过敏，从而引起贫血症状，此症状的出现与否与剂量无关，欧盟、美国等国规定在食品中氯霉素零容许量，即不得检出，且检出限的要求也越来越严格，欧盟由原来的10 μg/kg降至0.1～0.3 μg/kg，我国农业部第235号公告也规定氯霉素及其盐、酯在所有动物性食品中不得检出。氯霉素在食品中的残留问题不仅关系到人类的健康，对国际食品贸易也有着巨大的影响。

目前，国内外关于氯霉素残留检测方法已很成熟，主要采用酶联免疫法[2-5]、气相色谱法[6-10]、气相色谱-质谱法[11-13]、液相色谱法[14-16]、液相色谱-串联质谱法等[17-25]。酶联免疫法使用酶联免疫检验试剂盒，通常适合于大规模筛选，但由于抗体批次不同，测定结果将出现一定差异，重复性差，而且特异性很强，不能进行多残留检测，试剂昂贵，易出现假阳性结果[26-27]。气相色谱法、气相色谱-质谱法，一般需要衍生试剂进行衍生化[28]，方法较烦琐。液相色谱法灵敏度达不到要求[29]。高效液相色谱-串联质谱法，可通过第一级质谱选择出母离子，采用多离子反应监测技术极大地减少了背景干扰，降低噪音，提高灵敏度，是氯霉素残留检测的首选方法[30]，也是目前氯霉素检测方法的研究热点。但液相色谱-串联质谱仪价格昂贵，并未在一般实验室普及，2013年农业部关于农产品质量安全检测能力验证中水产品中氯霉素残留方法仍然规定的是气相色谱法，由此可见，气相色谱法仍是目前最易普及的方法，也是国际公认的氯霉素类药物定量检测方法。

由于水产品基质的组成成分十分复杂，样品处理不当，会对其中的氯霉素分析产生严重干扰。因此样品的净化至关重要。氯霉素类药物分析中，常用的净化方法主要是先用正己烷脱脂，再采用固相萃取法净化。但采用固相萃取法，需要进行萃取柱活化、上样、淋洗、洗脱等过程，操作麻烦。本研究建立了采用超声波萃取法，正己烷初步净化，及PSA固相吸附剂再净化，气相色谱电子捕获检测法测定水产品中氯霉素残留量的方法。

1 试验部分

1.1 材料与试剂

所有水产品（鳗鲡、鳜鱼、黄鳝、草鱼、鲫鱼、鲤鱼、鳊鱼、甲鱼、青蟹、大管鞭虾）采集于江西瑞金市、南昌市、九江市等地的水产养殖基地。

正己烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇均为色谱纯，氯霉素（纯度98.5%），N,O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）：三甲基氯硅烷（TMCS）（99:1）（衍生化试剂）；其他试均为分析纯。请在相应的试剂后补充生产厂家

1.2 仪器与设备

GC-450气相色谱仪，配电子捕获检测器，Centrifuge 5810高速离心机，R-215旋转真空蒸发仪，KD200可视氮吹仪，配5 mL模块，PSA吸附剂（N-丙基乙二胺，粒径50 μm），C18吸附剂（粒径50 μm）。

1.3方法

1.3.1 样品前处理方法

鱼，去鳞、去皮，沿脊背取肌肉；蟹、甲鱼，取可食肌肉部分；虾，去头、去壳、去附肢，取可食肌肉部分。样品切为不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块，用高速组织捣碎机匀质，密封，标明标记，并将试样于-18℃冷冻保存。实验时，将样品解冻，称取5.00 g于50 mL离心管中，加入20 mL乙酸乙酯，涡旋2 min，以480 W功率30℃下连续超声提取10 min，以6 000 r/min高速离心3 min，收集提取液于100 mL梨形瓶中，再往试样中加入10 mL乙酸乙酯，重复上述过程，合并提取液，于40℃水浴中减压旋转蒸发至干。残渣用1 mL甲醇溶解后，加入25 mL 4%氯化钠溶液，涡旋30 s，再加入15 mL正己烷，涡旋2 min，以6 000 r/min高速离心3 min，弃去上层正己烷相，再用10 mL正己烷重复提取一遍（如果试样含脂肪较多，可重复提取多遍）。水相中加入15 mL乙酸乙酯，涡旋2 min，以6 000 r/min高速离心3 min，吸取乙酸乙酯相，过无水硫酸钠脱水过滤于50 mL梨形瓶中，再向水相中加入10 mL乙酸乙酯，重复上述操作。用少量乙酸乙酯淋洗无水硫酸钠，合并提取液，于40℃水浴中减压旋转蒸发至干。加入2 mL丙酮溶解提取物并转移到5 mL具塞玻璃离心管中，用1 mL丙酮洗涤梨形瓶，合并丙酮溶解液，加入100 mg PSA吸附剂，涡旋30 s，以3 000 r/min高速离心3 min，吸取上清液于另一洁净5 mL具塞玻璃离心管中，于50℃干浴中吹氮蒸发至近干，再用1 mL丙酮洗涤离心管壁并吹氮蒸发至干，再加入100 μL衍生化试剂，涡旋混合30 s，在70℃烘箱中反应30 min后，再于50℃干浴中吹氮蒸发恰好至干。加入1 mL正己烷，涡旋混匀，取1 μL进入气相色谱分析。

1.3.2 色谱条件

DB-5MS毛细管气相色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Varian公司）；不分流进样；载气：高纯氮气（99.999%）；流速：2.0 mL/min；进样口温度：260℃；ECD检测器温度：300℃；程序升温条件：柱初始温150℃，保持1.0 min，以15℃/min的升温速度升至260℃，再以30℃·min-1的升温速度升至280℃，保持5.0 min；总运行时间24 min；进样体积：1 μL。

1.3.3 标准溶液配制

准确称取氯霉素标准品0.005 0 g，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，配制成500 mg/L标准储备液。再通过逐级稀释，甲醇定容，配制成氯霉素浓度为100 μg/L的标准使用液，4°C储存。

1.3.4 标准曲线的绘制

分别量取15、25、50、100、200、500、1 000 μL的标准使用液，于50℃干浴中吹氮蒸发至干，加入100 μL衍生化试剂，涡旋混合30 s，在70℃烘箱中反应30 min后，再于50℃干浴中吹氮蒸发恰好至干。加入1 mL正己烷，涡旋混匀，配制成氯霉素浓度为1.5、2.5、5、10、20、50和100 μg/L的7个浓度梯度的标准工作液，供GC-ECD分析。以峰面积为纵坐标，氯霉素浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.4 样品定量分析公式

式中：ρ为测定结果，μg/kg；C为上机浓度，μg/L；V为样品定容体积，mL；m为取样质量，g。本次试验V=1 mL，m=5.00 g。几个量和公式不对应，请核实

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

氯霉素微溶于水，易溶于乙酸乙酯、甲醇、乙腈等有机溶剂。甲醇、乙腈对人体毒性较大，且乙腈在挥干时容易冒泡，挥干时间长[12]，通常用于奶制品的提取，甲醇的极性比较大，提取液含杂质较多，而乙酸乙酯偏中性，提取液含杂质较少，提取效率高，毒性小[8]，容易挥干。本实验采用乙酸乙酯作为提取溶剂可以最大限度的从水产品中提取出有效成分并使共萃取的干扰物较少。

2.2 PSA净化条件的确定

对于某些样品，经正己烷去除脂质和类脂后，无需进一步净化便可满足分析方法要求，但对于净化不完全的样品需要进行进一步净化。文献报道比较多的是采用C18固相萃取柱[6-7,19]，硅胶固相萃取柱[14]，HLB固相萃取柱[25]，或者多种固相萃取柱相结合[13]的方法进行再净化。虽然固相萃取法能达到较好的净化效果，但使用固相萃取法步骤较多，需要进行萃取柱活化、上样、淋洗、洗脱等过程，过柱时间较长，过柱和洗脱过程中流速控制不当容易造成样品损失，而且固相萃取柱的成本也较高，不利于大批量样品的检测。本实验比较了PSA吸附剂、C18吸附剂在不同有机溶剂（正己烷、乙酸乙酯、甲醇、丙酮）中的净化效果，结果表明，C18吸附剂在不同有机溶剂（正己烷、乙酸乙酯、甲醇、丙酮）中的净化效果均不明显，PSA吸附剂在正己烷、乙酸乙酯中，会使目标化合物被完全吸附，最终检测不到任何氯霉素，PSA吸附剂在甲醇和丙酮中净化效果均较好。这说明采用PSA吸附剂净化时，吸附剂所处的溶剂影响很大，PSA吸附剂在非极性或若极性环境中会吸附氯霉素，而在极性环境中能起到较好净化效果。此外，若氯霉素衍生完毕后再采用PSA净化，结果表明随着PSA剂量的增大，当使用50 mg PSA时，便检测不出衍生反应产物。考虑到最终定容试剂为正己烷，本试验先净化后衍生。另一方面，PSA吸附剂与C18吸附剂净化效果的差异，可能是因为PSA吸附剂能有效的去除食品中影响农残检测的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、酚类、一些极性色素，以及糖类等干扰，C18吸附剂主要用于去除脂肪和酯类等非极性干扰物，而在上一步正己烷净化中已除去大部分的脂质和类脂，因此，C18吸附剂吸附效果不佳。考虑到甲醇毒性较大，且沸点也较高，选择用丙酮溶解提取物，在丙酮中用PSA吸附剂净化。此外，考察了不同量（0～200 mg）的PSA吸附剂对净化效果的影响。结果表明，随着PSA吸附剂量的增加，净化效果有所增加，但由于PSA吸附剂会吸附一定的丙酮，用的越多，回收率会有所下降，最终选择使用100 mg PSA吸附剂，此时既能达到较好的净化效果，又能保证较高的回收率。

2.3 衍生条件的确定

由于氯霉素结构中，含有羟基、氨基、硫酰基及亚胺基，都有很强的极性、热稳定性差、难挥发，在采用气相色谱法分析此类化合物时，需对其极性官能团进行酯化、硅烷化或酰化，生成热稳定性和易挥发的衍生物。本实验利用硅烷化试剂将氯霉素的羟基硅烷化衍生成易挥发热稳定的物质。由于衍生化试剂遇水易分解，会造成目标化合物衍生不成功，因此，必须保证衍生过程中无受潮。同时，衍生完毕后，多余的衍生溶液必须通过吹氮蒸发恰好至干，过头或未干，均会影响衍生效果。因此，本实验选用可视氮吹仪，随时观察氮吹过程。

2.4 方法评价

2.4.1 方法的线性范围及检出限

将配制好的7个浓度梯度的标准系列，按照样品分析相同的色谱条件进行GC-ECD分析。用外标法绘制出浓度-峰面积校正曲线。氯霉素在1.5～100 μg/L浓度范围内呈良好线性关系。各组分的线性范围、线性回归方程及相关系数见表1，根据三倍信噪比测得氯霉素检出限分别为0.1 μg/kg。氯霉素的标准气相色谱图如图1。

图1 氯霉素（20 μg/L）标准色谱图Fig.1 Standard chromatogram of 20 μg/L of CAP

表1 回归方程，线性范围，相关系数和检出限Tab.1 Regression equation,linear range and detection limit(S/N=3)

2.4.2 方法的精密度和回收率

为考察基体效应以及验证方法准确性和重现性，分别准确称取鳗鲡、鳜鱼、大管鞭虾样品5.00 g，按照前述处理方法三次平行测定，均未检出氯霉素，再分别往5.00 g鳗鲡、鳜鱼、大管鞭虾样品中各加入15 μL、75 μL和200 μL的混合标准使用液，配制成低（0.3 μg/kg）、中（1.5 μg/kg）和高（4 μg/kg）3种浓度的加标样品，分别进行5次平行测定，精密度及回收率结果见表2。结果表明，鳗鲡、鳜鱼、大管鞭虾样品加标回收率为分别为92%～103%、86%～108%和78%～99%，RSD范围分别为3.5%～4.2%、3.1%～4.6%和2.6%～3.9%（n=5）。结果表明，该方法基体效应可以忽略，精明度和准确度满足分析方法要求。图2为大管鞭虾样品和加标大管鞭虾样品气相色谱图。

图2 大管鞭虾样品（A）和加标大管鞭虾样品（CAP：1.5 μg/kg）（B）气相色谱图Fig.2 Chromatogram of(A)Solenocera melantho and (B)spiked Solenocera melantho with 1.5 μg/kg of CAP

表2 鳗鲡、鳜鱼、大管鞭虾中氯霉素的加标回收实验及方法的精密度实验结果（n=5）Tab.2 Results of recoveries and RSDs(n=5)of CAP in spiked eel,mandarin fish,and Solenocera melantho by the proposed method

2.5 实际样品分析

取采集于江西瑞金市、南昌市、九江市等地的水产养殖基地的鳗鲡、鳜鱼、黄鳝、草鱼、鲫鱼、鲤鱼、鳊鱼、甲鱼、青蟹、大管鞭虾，分别进行氯霉素含量测定，所有样品中均未检出氯霉素，满足我国以及欧盟、美国等国对水产品中氯霉素限量的要求。

3 结论

本实验采用超声波萃取，PSA净化和气相色谱电子捕获检测法技术，对水产品中氯霉素进行了测定。该方法简单、灵敏、重现性好、准确度高、回收率令人满意，基体干扰小，能满足水产品中氯霉素的分析要求，并进一步应用到其他食品中氯霉素的检测。

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Determination of Chloramphenicol and Florfenicol in Fishery Products by Gas Chromatography Combined with Ultrasonic Extraction and PSA Purification

HU Hong-mei,GUO Yuan-ming,SUN Xiu-mei,et al
(Institute of Marine and Fisheries of Zhejiang Ocean University, Key Laboratory of Mariculture and Enhancement of Zhejiang Province,Marine Fishery Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China)

A simple,efficient,sensitive,and low matrix interference method for determination of chloramphenicol(CAP)in fishery products using gas chromatography-electron capture detector(GC-ECD)has been developed.The samples were treated by ultrasonic extraction with ethyl acetate and n-hexane purification.Further purification of the extracts was processed by a moderate amount of primary secondary amine (PSA)sor－bent.Then the purified solutions were derivatized with slilyl reagents.The linearity of the method ranged from 1.5 to 100 μg/L for CAP,with correlation coefficient of 0.999 6.The limits of detection was 0.1 μg·kg-1.The recoveries of spiked CAP with external calibration method at different concentration levels in different matrix of samples(eel,mandarin fish,and Solenocera melantho)were 92%-103%,86%-108%,and 78%-99%,respectively,and with relative standard deviations of 3.5%-4.2%,3.1%-4.6%,and 2.6%-3.9%(n=5),respectively.It is concluded that this method can be successfully applied for the determination of CAP in fishery products.

ultrasonic extraction;primary secondary amine;gas chromatography-electron capture detector;fisher products;choramphenicol

S859.84

A

1008－830X(2016)03－0222－06

2016-03-20

国家自然科学基金（21407127）；浙江省科技计划项目（2016F30021；2016F50040）

胡红美（1986-），女，工程师，硕士，研究方向：渔业环境与水产品质量安全.E-mail:huhm@zju.edu.cn

顾蓓乔（1963-），男，上海市人，研究方向：水域环境及食品加工.E-mail:gbq@zjou.edu.cn