液体活检在常见肿瘤中的应用

杨延巍 刘彦虹

液体活检在常见肿瘤中的应用

杨延巍 刘彦虹

目前治疗肿瘤的手段多种多样，已经不完全局限于传统的手术切除及放化疗等，分子靶向治疗药物的普及使“精准医学”正逐步被应用到临床肿瘤领域。肿瘤精准医学将个体疾病的遗传学信息、诊断、治疗三者结合，使肿瘤的诊治更具有针对性、靶向性和特异性。液体活检是一种新兴的无创检测技术，该项技术是通过采集患者体液（包括血液、唾液、汗液及分泌物等）对体内的肿瘤或移植器官状态进行监测的方法。了解和临床应用这项检测技术对肿瘤的诊断尤为凸显。本文综述了液体活检的生物学特性及其在常见肿瘤精准治疗的应用。

恶性肿瘤； 应用； 液体活检； 循环肿瘤细胞； 循环肿瘤DNA； 精准医疗

恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的一类疾病，肿瘤复发和转移是患者死亡的主要原因。肿瘤治疗前需要一个精确的组织学或细胞学诊断来确定治疗方式。目前常用的组织活检是有创的、局限的。近年来肿瘤分子生物学发展起来的液体活检，具有无创、全面、反复性强等优势，对早期发现肿瘤微转移、靶向治疗和疗效以及预后判断具有重要意义［1］。液体活检主要包括循环肿瘤DNA（circulatin umor DNA，ctDNA）、循环肿瘤细胞（circulatin umor cells，CTC）、外泌体检测等，目前对ctDNA和CTC研究较多。2016年1月，国家食品药品监督管理局批准了首个CTC检测试剂盒，液体活检技术正式应用于临床。

一、常见的几种液体活检的技术方法

（一）循环肿瘤DNA检测

循环游离DNA（circulatin ell-free DNA，cfDNA）是存在于血液、脑脊液等体液中的一种胞外DNA，以单链或者双链DNA、DNA蛋白质复合物等形式存在，大小为150～210 000 bp［2］。1948年Mandel和Metais［3］首次在健康人血中发现了循环游离DNA（ctDNA）。而癌症患者的循环DNA于1977年才发现。对于癌症患者而言，cfDNA不仅来源于体内凋亡的细胞释放DNA入血，也来源于脱离肿瘤组织入血的CTC，这种来源于肿瘤细胞的DNA被称为循环肿瘤DNA（ctDNA）。健康人体内巨噬细胞和溶酶体的清除作用，使其血液中的cfDNA含量维持在较低水平［4］。肿瘤细胞呈指数增长，大量癌细胞播散及坏死所释放的核酸超过机体正常的清除能力，癌症患者ctDNA升高，因此ctDNA可以鉴别肿瘤细胞［5］。

（二）循环肿瘤细胞的特点

循环肿瘤细胞是异常的肿瘤细胞或微小血栓，来自于原位肿瘤细胞脱落或者是肿瘤转移至血道的细胞。肿瘤细胞进入循环系统后，大部分因机体的免疫系统或机械作用而损伤，或者因其自身凋亡短期内死亡，只有很少一部分具有高活力和高转移潜能CTCs能够存活下来，并在远处脏器中定植，发展成为转移灶［6-7］。Driemel等［8］发现处于增殖期的癌细胞高表达上皮细胞粘附分子（epithelia ell adhesio olecule，EpCAM），EpCAM低表达则可抑CTCs的增殖。也有学者发现存在于外周血中呈孤立状态者的CTCs多处于凋亡状态，而CTCs细胞簇中并没有此现象［9-10］，说明以细胞簇状态聚集存在的CTCs可避免“失巢凋亡”，并且对细胞毒性药物具有更高的耐受性。

（三）小分子核糖核酸

小分子核糖核酸（microRNA）是小的非编码单链RNA，约19到22个核苷酸长度，作为沉默RNA，反向调节转录后的基因表达水平［11］。MicroRNA有多个细胞功能，如生长、增殖、新陈代谢及细胞凋亡。mRNA的作用首次在慢性淋巴细胞白血病中显示出来［12］，迅速生长的个体证明了他们的起源和肿瘤多形态的进展，包括肺癌［13］。在创新性研究中，Lu等［14］首先强调了MicroRNA在肿瘤学中诊断生物标志物具有潜在作用。因此MicroRNA分子可以帮助癌症患者的诊断、预测和预后。血清MicroRNA具有的几个优势：稳定、组织特异性表达或生物特异性表达，容易检测［15］。然而，MicroRNA作为生物标志物，其诊断、预后、个性化治疗和疾病管理仍处于初始阶段。

二、液体活检在肿瘤精准诊断和治疗中的应用

（一）结直肠肿瘤

ctDNA水平对肿瘤高危人群的早期筛查和肿瘤早期诊断具有重要意义，还可检测肿瘤基因中特定位置的基因缺陷，对临床晚期患者应用靶向药物治疗具有指导意义，并且可以监测预后。Jahr［16］通过检测结肠癌和健康人中的血清DNA水平和CEA水平，表明结肠癌患者ctDNA水平比健康人明显升高。Grutzmann等［17］与Warren等［18］对不同分期CRC患病人群开展回顾性研究，对比血浆ctDNA中甲基化SEPT9基因（mSEPT9）水平，结果显示，SEPT9基因异常甲基化对CRC诊断的敏感度为72～90%，特异度为88～90%。Allegra等［19］指出用抗EGFR抗体药物治疗转移性结直肠癌时，患者要进行肿瘤基因型测试，当检测出KRAS 12或13号密码子基因突变时，应避免使用抗EGFR抗体对其进行治疗，选用EGFR单抗（西妥昔单抗或帕尼单抗）对其进行治疗有效。在转移性结直肠癌患者中使用定量PCR检测ctDNA中KRAS突变水平，低水平的KRAS突变说明使用第三代西妥昔单抗和伊立替康治疗后可以稳定疾病状态。高浓度血浆KRAS和BRAF突变提示结直肠癌靶向治疗后预后不良。

（二）乳腺癌

循环肿瘤细胞中的一部分细胞可能发生上皮间质转化（epithelia esenchyma ransition，EMT），造成上皮细胞特异性分子标志物丢失，间质细胞的特异性分子标志物呈高表达状态，发生转移的机会增加［20-23］，因此CTC可以用来监测乳腺癌的早期转移。Aktas等［24］研究转移性乳腺癌患者外周血中CTCs时发现，Twist1、蛋白激酶B以及磷脂酰肌醇-3激酶α等EMT相关的分子标志物均有不同程度的表达升高。Papadaki等［25］通过免疫荧光共定位分析发现乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）和Twist在乳腺癌不同阶段中的表达水平也不同，在早期乳腺癌患者的CTCs中，ALDH1呈低表达或者阴性，Twist多呈阴性且主要定位于胞质；而在乳腺癌晚期且发生转移患者的CTCs中，ALDH1则呈高表达，Twist主要定位于细胞核内，且两者多共定位于同一细胞内。

（三）肺癌

miRNA可以区分肺癌和正常组织［26-27］，小细胞癌和非小细胞癌，腺癌和鳞状细胞癌［28-29］。循环miRNA，主要检测早期非小细胞肺癌，并作为早期的潜在生物标志物检测疾病的复发［30-31］。Shen等［32］报道，非小细胞肺癌患者和健康对照组的miR-21，miR-126，miR-210和miR-486-5-p的敏感性和特异性分别为86%和96%。miR的表达可以在肺癌根治性切除术后发生改变［33-36］。Le等［35］研究发现原发肿瘤miR的表达可以发生改变，miR-21，miR-205，miR-30d，miR-24的表达增加，Aushev等［36］研究显示miR-205，miR-19a，miR-19b，miR-30b，miR-20a的表达增加。CTC计数还可以反映患者对治疗的反应。研究显示，小细胞肺癌化疗后较化疗前CTC计数明显减少，且化疗后CTC计数与临床预后和死亡风险呈显著相关，证明CTC计数对扩散性小细胞癌患者预后有显著意义［37］。用分离的转移性NSCLC患者的外周血CTC进行EGFR突变和酪氨酸激酶抑制剂耐药相关基因检测，检出率可高达92%，且对分子靶向药物使用具有良好指导作用［38］。

三、液体活检技术的优势与展望

循环肿瘤DNA检测通过采集患者外周血，即可获得体内肿瘤细胞的基因组信息，是一种突破性的革新技术。与传统的穿刺活检等方法比较，液体活检具有以下独到的优势：（1）无创，重复性好。对于晚期或不宜手术患者，可以再次或多次取材，监测肿瘤细胞；（2）取样全面，避免肿瘤异质性带来的取样不全；（3）精准，直接获得肿瘤基因组信息，同时用于指导后续靶向治疗；（4）早期血液中获得CTC和ctDNA由其本身的生物学特性（半衰期都在24 h之内）是最新鲜、实时的；（5）多种基因联合筛查可以提高敏感度及特异度。

目前为止，对CTCs的研究多为临床研究，且大多只停留在外周血CTCs计数的层面，而对其生物学特性以及基因型和表型的变化等基础研究则相对较少，对其更深层次的认识相对不足。随着对CTCs研究的深入，逐渐发现CTCs的生物学特性以及基因型和表型的变化有助于了解其在肿瘤耐药以及转移等方面的作用，为肿瘤早期诊断、个体化治疗方案的选择、预后评估以及癌细胞远处转移的风险预测等提供更可靠的依据，甚至能为癌症的治疗带来新的方法。总之，CTCs的研究有着很好的应用前景，并能为肿瘤研究的领域提供新的研究方向。

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The application of liquid biopsy in common tumors

Yang Yanwei, Liu Yanhong.
Department of Clinical Laboratory, Second Aff i liated Hospita f Harbin Medical University, Harbin 150086, China
Correspondin uthor: Liu Yanhong, Email: liuusa2016@163.com

Nowadays, ther r an ifferen ethod o h reatmen ancer, suc s traditiona urgica esectio n adiotherap n hemotherapy. Th opularizatio olecula argeted therap rug a raduall ee pplie h iel linica ncology. Tumo recisio edicin an combin it ndividua iseas eneti nformation, diagnosi n reatment, s ha h iagnosi nd treatment of cancer is more targeting and specif i city. Liquid biopsy is a new noninvasive detection technique tha se onito h tat tumo ransplante rga patien ollectin od luid (includin lood, saliva, sweat, an ecretions). Knowin n pplyin hi etectio echnolog linical i articularl rominen h iagnosi h umor. Thi ape eviewe h iologica haracteristic f liquid biopsy and its application in the treatment of common tumors.

Malignan umor; Application; Liquid biopsy; Circulatin umo ells; Circulating tumor DNA; Precisio edicine

2017-01-19）

（本文编辑：赵志勋）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.02.011

150086 哈尔滨医科大学附属第二医院检验科

刘彦虹，Email：liuusa2016@163.com