干细胞在内耳毛细胞再生中的应用

吴佳源 刘俊⋆

·综述·

干细胞在内耳毛细胞再生中的应用

吴佳源 刘俊⋆

根据世界卫生组织统计，全球约有2.78亿人患有耳聋疾病［1］。永久性听力损失是由于耳蜗内的毛细胞丧失了再生能力［2］。目前恢复因耳蜗毛细胞丢失而引起的中重度听力损失的唯一方法是使用人工耳蜗或助听器直接刺激听神经。但其使用受限于复杂的听力损伤机制和组织损伤程度［3］。理想的解决方案是用干细胞、基因、药物治疗阻止耳蜗毛细胞的丢失或再生耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元［4］。本文对干细胞再生耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元作如下综述。

1 内耳干细胞

在哺乳动物中，毛细胞的生成只出现在早期胚胎形成过程中相对较短的时间内。在成熟的Corti器里，一旦毛细胞死亡，其便不会再生［5］。尽管哺乳动物内耳不能再生丢失的毛细胞，但仍然有证据表明哺乳动物内耳具有某种再生能力的细胞，因可以从前庭感觉上皮和新生的耳蜗中分离出这种细胞［6］。这些细胞被称之为内耳胚胎干细胞。

非哺乳脊椎动物的内耳胚胎干细胞存在于内耳感觉上皮区且这些细胞可以产生一个显著再生反应。与此相反，哺乳动物的内耳干细胞仅存在于年轻内耳感觉上皮，其数量会随时间的推移显著降低（耳蜗甚至会降到零）。虽然这些细胞数目较少，仅占一个椭圆囊细胞中0.025%的细胞，但其拥有干细胞最重要的特征即自我更新和具有多功能性［7］。最近的一些研究发现，哺乳动物幸存的支持细胞也可以被诱导横向分化成新的毛细胞［8］。哺乳动物耳蜗的支持细胞和鸟类耳蜗毛细胞来源于相同的祖细胞。然而在成年哺乳动物中，对于耳蜗毛细胞的损伤，这些支持细胞并不能做出反应而自发的分化成毛细胞［9］。这可能是由于相应信号的缺乏或某种抑制剂的存在而导致成年哺乳动物前庭上皮的低再生能力［10］。

在内耳发育过程中细胞周期抑制因子起着重要作用。例如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白（CDK抑制蛋白）—p27kip1及p19Ink4d。p27kip1的表达在毛细胞的分化过程中逐渐下降，而在成熟Corti器的有丝分裂后期支持细胞中却持续表达。这表明p27kip1的一个主要作用便是维持支持细胞的静息状态。这也暗示抑制p27kip1的表达可以促进感觉细胞的前体细胞增殖，同时对于哺乳动物听力器官中毛细胞再生的诱导提供一条重要途径。p19Ink4d的作用 跟p27kip1一样，其共同作用维持着已分化的感觉细胞的静息状态［11］。内耳毛细胞增殖同样也受成视网膜细胞瘤蛋白（RB蛋白）控制。RB蛋白的主要作用同样也是维持细胞的静息状态［12］。研究发现抑制老鼠未分化毛细胞的前体细胞RB蛋白的激活可以导致耳蜗毛细胞的扩增及新的毛细胞的生成［13］。临时或永恒抑制这些细胞周期抑制因子也许会生成新的毛细胞和支持细胞，这也给治疗感音神经性耳聋提供一种新的治疗方法。ATOH1基因编码转录因子Math1有助于神经元和耳蜗毛细胞的生成，当一些哺乳动物的支持细胞的转录因子Math1被过表达时，这些细胞便会改变形态以增加耳蜗毛细胞纤毛的数量，同时也会促进脑干诱发电位的功能恢复［14］。近来研究发现notch信号在毛细胞和支持细胞的分化过程中起至关重要的作用［15］。当notch信号被抑制时，新的毛细胞可以被诱导生成，还发现噪音刺激引起的听力损伤可以被部分恢复［14］。

因此在耳聋动物的耳蜗里对于细胞周期抑制因子、ATOH1基因和notch信号通路的调控可能是一种让毛细胞再生的有效方法。

2 外耳干细胞

2.1 骨髓间充质干细胞 骨髓间充质干细胞（也称为骨髓基质细胞）是多能的且能在体内和体外修复组织。骨髓间充质干细胞可以产生骨和软骨且还能分化成肌细胞、肝细胞和胶质细胞及最重要的神经细胞。由于这些原因，间充质干细胞是一种用于干细胞替代疗法的有前景的细胞来源。

Jae-Hong Lee等从SD大鼠骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞进行体外培养14d后发现，间充质干细胞分化成神经细胞和施万细胞的比例远高于毛细胞［16］。Sujeong Jang等成功将神经诱导的人类间充质干细胞移植入成年雌性豚鼠耳蜗，发现被植入的细胞主要存在于受损耳蜗的螺旋神经节、Corti器及耳蜗神经，且这些细胞可以存活8周。在注入NI-hMSCs后的成年雌性豚鼠与注入平衡盐溶液的对照组比较，发现前者的螺旋神经节细胞的数目有所增加，被嫁接的人类间充质干细胞也表达一种成熟的神经元标志—MAP2。这表明人类骨髓间充质干细胞可以分化成神经细胞且可以替代丢失的螺旋神经节细胞［17］。因此间充质细胞可以被用来治疗因螺旋神经节退化而导致的神经性听力损失和提高人工耳蜗植入的成功率［18］。

2.2 神经干细胞 成人神经干细胞具有自我更新能力和多能性。神经干细胞可以从发育中的大脑区域中分离获得，包括大脑皮层、海马、纹状体、嗅球、螺旋神经节神经元和嗅觉上皮［19-20］。移植的神经干细胞被证明可以迁移至脑损伤部位并分化成原生的细胞类型，诸如少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、皮质神经元和脊髓神经胶质和神经元。这些结果表明，神经干细胞既能替换损坏的神经组织又能恢复损伤后的功能。

Parker等将克隆神经干细胞（cNSCs）注入至听力受损的小鼠和豚鼠的鼓阶中，6周以后，在两组动物模型中的一些cNSCs均出现在整个耳蜗中并显现出神经耳蜗组织（例如：螺旋神经节神经元，卫星细胞和雪旺细胞）和柯蒂器细胞（柱细胞、支持细胞和毛细胞）的形态学，蛋白质和基因的特征。被植入的cNSCs在形态学和蛋白质表达上的不同取决于其在耳蜗内所处的位置，这表明耳蜗内的微环境对cNSCs的发展起到重要作用。一旦这个神经干细胞系迁移至耳蜗内，接受来自微环境的信号后，这些细胞便表达由内耳细胞表达的细胞基因命运程序，并对该程序进行正反馈和负反馈的调节以达到平衡。这些结果表明干细胞具有发展潜力。同时也表明成年哺乳动物耳蜗内还保留着一些信号，这些信号对于干细胞沿着耳蜗的表型分化是必要的，尽管这些信号并不能作用于内耳的细胞群从而再生这些细胞［21］。

2.3 胚胎干细胞 胚胎细胞的巨大潜力在于其在无限增长的同时还能保持多能性，且可以分化成所有三个胚层的细胞。人类干细胞可以被用来治疗较多疾病，比如帕金森疾病、脊髓损伤和糖尿病。然而其生产需要摧毁胚胎，这便会在某些群体中引发强烈的道德反对。此外，使用这些细胞进行同种异体移植可能会引发免疫排斥且需要使用免疫抑制剂。在2006年，由于山中伸弥等在实验上的突破，这些问题似乎已经被规避。作者介绍一种方法即通过人为表达四种基因（转录因子OCT4，MYC，SOX2和KLF4）重新编程成纤维细胞使之进入多能状态（类似胚胎干细胞）［22］。

2.4 人工诱导的多功能干细胞 尽管诱导的多功能干细胞（iPSCs）的治疗前景巨大，但这可能是一个错误忽视胚胎干细胞，以完全专注在iPSCs。可以预期的是控制iPSCs分化的信号和规则和管理人类胚胎干细胞的信号和规则是一样的。然而，已有证据表明iPSCs分化成特地谱系细胞的成功率是高度可变的［23］，且其可能遭受大量基因组的变异。

Niliksha Gunewardene等用两种诱导的多功能干细胞（hiPSCs）和一种人类胚胎干细胞（hESCs），使其朝一个特定的感觉神经细胞谱系（neurosensory lineage）分化。实验发现，在体外35d，hiPSC和hESCs衍生的感觉神经祖细胞均有感觉神经标志物的高表达水平。此外，从该实验中所产生的神经元被认为是有电活性的。虽然所有的细胞系均产生有功能的感觉神经样祖细胞，但与hESCs相比较，hiPSCs在神经标志物表达水平上是可变的。总体而言，这些结果表明，hiPSCs有能力分化成感觉神经细胞系，但必须提高hiPSCs分化成所需要谱系的一致性［24］。

3 最适合用于再生内耳的干细胞

理论上，胚胎干细胞是对于内耳细胞的恢复最好的选择。然而，有证据表明一些胚胎干细胞谱系能够发展成为肿瘤，在细胞移植后产生不良组织。另外，获取胚胎干细胞需要破坏胚胎，这在伦理角度上受质疑。

神经干细胞可以从器官获取，这在伦理上似乎是被认可的。然而，一旦神经干细胞只在大脑深部区域被发现，那么对于神经干细胞有限的获取方式会阻碍其临床应用。另一方面，间充质干细胞的获取较容易且在其分化过程中也可以产生神经元细胞。再加上其能产生神经营养因子，它们能增加神经元的数量且对螺旋神经节有支持保护作用，这也潜在的提高电子耳蜗的植入效率［25］。但骨髓间充质干细胞移植进耳蜗后存活的比例较低，Matsuoka等把BMMsC移植进蒙占沙鼠耳蜗内，发现鼓阶注射的细胞存活率仅为0.54‰，蜗轴注射的存活率仅为0.59 ‰，而存活的细胞中也仅有少部分能分化为内耳功能细胞表型［26］。

对比神经干细胞和成人内耳干细胞在体外分化成内耳毛细胞的实验，它们之间有两个不同：（1）内耳干细胞的分化能力是神经干细胞的100倍。（2）内耳干细胞比神经干细胞能更完全的分化成毛细胞［27］。

动员内源性干细胞为替代损坏的内耳毛细胞提供了一种新方式。动员宿主干细胞不需要像移植外来细胞（如胚胎干细胞和非胚胎干细胞）进入耳内那样复杂，避免了移植方式的选择，移植过程中造成的手术创伤，移植排斥反应，无节制移植细胞的增殖和肿瘤形成。因此内耳干细胞对于耳蜗毛细胞的修复可能是最好的选择［28］。

4 总结

目前，用干细胞移植治疗来恢复听力在临床上尚未得到应用。对于听力的恢复，不可能使用单一的方法，需要对多种治疗方法进行联合以提高治疗效率，这些方法包括对细胞周期机制的基因操作，通过基因疗法诱导毛细胞的生成，干细胞移植进入受损的耳蜗、耳蜗神经及耳蜗核神经元。由于毛细胞可以从支持细胞中再生，通过横向分化再生毛细胞的机制将会明显提高治疗听力损失措施的潜力［29-30］。

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浙江省教育厅（Z201119721）；浙江省卫生厅（200913120）

310053 浙江中医药大学第一临床医学院（吴佳源）310006 浙江省中医院（刘俊）*通信作者