连翘叶提取物对小鼠的急性毒性实验研究

侯苏方 ，史向华 ，柴秋彦

(1. 山西省中医学校，山西 太原 030012； 2.山西省医药与生命科学研究院，山西 太原 030006 )

·基础医学·

连翘叶提取物对小鼠的急性毒性实验研究

侯苏方1，史向华2，柴秋彦2

(1. 山西省中医学校，山西 太原 030012； 2.山西省医药与生命科学研究院，山西 太原 030006 )

目的：研究连翘叶提取物对小鼠的急性毒性，为临床安全使用提供参考。方法：观察受试样品1次经口给予动物引起的不良反应和死亡情况，确定半数致死剂量或最大耐受量。小鼠1次经口灌胃给予连翘叶提取物后，连续观察2周，记录出现的反应及死亡率；实验结束时称量体重，解剖动物，称量脏器湿重，计算脏器系数并测定部分血液生化指标。结果：连翘叶提取物1次经口灌胃给予动物不能求得半数致死量和最大耐受量,最大给药量为61.60 g/kg; 实验2周后，血清丙氨酸氨基转移酶、谷草氨基转移酶、肌酐、尿素氮含量均无明显改变；体重、脏器湿重及脏器系数与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05) 。结论：连翘叶提取物对小鼠的急性毒性很小，临床应用安全性较高。

小鼠；急性毒性；连翘叶；提取物

连翘为临床常用清热解毒药，味苦且性微寒，归肺、心和胆经，具有清热解毒、消肿散结及疏解风热的功效，在中医临床具有广泛应用；现代药理研究也表明其有多方面的药理作用[1]。连翘在华北地区分布广泛，野生资源丰富，但由于使用量越来越大，开发不平衡，产地连翘资源仍然十分紧缺。近年来研究表明，连翘叶中所含连翘苷和连翘酯苷等有效成分与连翘相似，且抗菌效果优于果实，为一巨大的潜在替代资源，已经成为研究热点[2]。有关连翘叶提取物的毒性研究已有少量报道，但结果仍有差异，为了解本省连翘叶使用的安全性，本文观察研究了连翘叶提取物对小鼠的急性毒性(单次给药)实验，报告如下。

1 实验材料

1.1 样品

连翘叶采自山西晋东南地区陵川县境内，时间为2016年5月下旬～6月上旬。阴干后粉碎成粗粉，过20目筛备用。

1.2 试剂

肌酐(CER)、尿素氮(BUN)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒购自北京中生北控生物科技股份有限公司;生理盐水：石家庄四药股份有限公司厂生产，批号：051110322；其他试剂均为市售分析纯。

1.3 实验动物

小鼠，雌雄各半，体重22～26 g,购自中国医学科学院实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2010-0003；饲养于山西省医药与生命科学研究院清洁级动物室，许可证号：SYXK(晋)2010-0005；实验室温度20±1℃、相对湿度40%～70%，全价营养颗粒饲料及消毒垫料均由山西医科大学实验动物中心提供。实验室适应3d后使用。

1.4 主要仪器及器皿

电子天平；100mL三角烧瓶；50mL烧杯；高压灭菌器；蓝芯玻璃注射器(1mL)；全自动生化分析仪(SELECTRA-E，荷兰威图)

2 实验方法

2.1 样品处理

连翘叶水提取物的制备。称取干燥连翘叶(由课题组采于陵川)100 g，加800 mL去离子水，浸泡2 h后，煎煮提取30 min，滤出煎液，药渣中再加500 mL去离子水20 min，过滤，合并2次滤液，溶液浓缩至体积为65 mL(浓缩体积根据溶液的黏稠度及抽药灌胃是否顺利情况而定)，浓度为1.54 g/mL(生药/mL)，置4 ℃冰箱中储藏备用。

2.2 测定方法

2.2.1 预试验 取小鼠24只，雌雄各半，随机分4组，每组6只；实验前16 h禁食不禁水；以连翘叶水提取物最高浓度1.54 g/mL体重为高剂量，0.77 g/mL体重为中剂量，0.38 g/mL体重为小剂量，均按0.4 mL/10 g灌胃给药1次；灌胃后常规饲养，观察14 d，记录小鼠死亡数，找出使小鼠0%和100%致死的药物浓度，进而以改良寇氏法求得半数致死量；如高剂量组部分小鼠死亡，则进行最大耐受量(MTD)测定。若无小鼠死亡，则采用最大给药量(MLD)测定。

2.2.2 半数致死量测定 取体重(20±2.0 g)小鼠，禁食不禁水过夜(16 h)后随机分组， 每组10只，共6组。分别1次经口灌胃给予上述制备的样品溶液，依据中华人民共和国标准急性毒性试验要求，每组给药量均为0.2 mL/10 g，从最大浓度1.54 g/mL开始，浓度依次按1：0.70～0.90等比递减。分别在给样品后0、1、2、4、12、24、48 h各观察1次，记录反应情况及死亡情况。然后每日观察1次，连续观察14 d。记录反应情况及死亡率,计算LD50。

2.2.3 最大给药量(MLD)测定 取体重20±2.0 g小鼠，禁食不禁水过夜(16 h)后随机分组，分别为对照组、样品组，每组10只，雌、雄各半。用药组1 d内连续2次(间隔4h)灌胃，每次剂量为0.2 mL/10 g；对照组给予等容量生理盐水。然后连续观察14 d，记录反应情况及死亡率,计算MLD。

2.2.4 体重、大体解剖、生化指标及脏器系数的测定分别在给药后第0、7、14 d时称重，第14天将小鼠断头处死后采集血样测定血液生理生化指标，剖检观察各组小鼠主要脏器(心、肝、睥、肾)是否有异常变化，比较各组小鼠体重及脏器系数(心脏、肝脏、肾脏、脾脏与体重的比值)。

2.2.5 动物反应的观测内容 给药后连续观察14 d,给药当天结束后4h内严密观察动物的毒性反应。以后观察时间内每天早、晚各观察1次。并记录动物反应情况。观查内容：a)神经系统：行为及反应、异常运动、对刺激的反应、神经反射。b)呼吸系统：呼吸及其频率、分泌物。c)胃肠系统：粪便性状、腹部形态。d)泌尿生殖系统：会阴部(污秽)、外生殖器(肿胀)。e)眼：眼睑(下垂)、眼球(突出、震颤等)。f)解剖检查：实验结束时解剖动物，肉眼观察心脏、肝脏、肾、脾、肺及胃肠等脏器的体积、颜色、质地等变化。如发现动物死亡立即进行尸检，观察组织器官出现是否改变，记录并在出现肉眼可见变化时进行组织病理学检查。

2.3 统计学方法

3 实验结果

3.1 LD50及最大耐受量

一次性灌胃 1.54 g/mL、0.4 mL/10 g后，高剂量组动物出现倦伏、活动减少，20 min后基本恢复正常，其余均未观察到与用药有关的不良反应。连续观察14 d，动物均无死亡。低剂量组动物未出现倦伏、活动减少等症状，外观无异常，亦无死亡，在本实验所用浓度及条件下不能求得LD50及最大耐受量，故进行最大给药量测定

3.2 最大给药量

1 d内连续两次(间隔4 h)灌胃，给药总剂量为0.4 mL/10 g后，动物均出现倦伏、活动减少，20～30 min后基本恢复正常，其余未观察到与用药有关的不良反应。与对照组比较无明显差异。连续观察14 d，动物均无死亡。实验结束后解剖动物，亦未发现有肉眼可见的病理变化。故最大给药量为61.60 g/kg(相当于生药量)。

3.3 体重变化结果

分别通过测量和记录对照组和样品组的体重变化，结果说明连翘叶提取物不会影响小鼠的生长。见表1。各组小鼠体重无明显变化(P>0.05)。

Table 1 Changes of Body Weight%

3.4 脏器病理剖检与脏器系数变化

14 d后处死动物，解剖后肉眼观察心、肝、脾、肺、肾、胃肠等重要脏器变化；结果显示样品组与对照组小鼠各脏器色泽正常，未见出血、坏死、肿大等病变。测定脏器系数的结果见表2，两组对比无统计学差异(P>0.05)。

Table 2 Changes of Organ Coefficientg/100g

3.5 血液生化指标的变化

采集到的血样测定以下生化指标：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酐(CER)、尿素氮(BUN)，来说明连翘提取物对小鼠肝肾功能的影响。结果见表3，血液谷丙氨酸氨基移换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基移换酶(AST)等值均在正常范围且与对照组比较无统计学差异(P>0．05)。

ALT(IU/mL)AST(IU/mL)BUN(mmol/L)CRE(μmol/L)对照组雌性26．55±8．07116．95±10．056．04±1．0727．36±3．88雄性24．68±8．22125．89±12．095．48±0．7428．34±3．48样品组雌性24．88±9．30128．21±13．655．42±1．6926．5±3．02雄性25．36±6．08120．36±15．226．32±0．8527．3±1．04

4 讨论

连翘叶提取物因受试物浓度或体积限制，一次灌胃在本实验所用浓度下不能求得LD50、最大耐受量(MTD)，所以作了最大给药量试验。连翘叶提取物在最大药物浓度、最大体积下灌胃给药，未出现小鼠死亡，其最大给药量(MLD)为61.60 g/kg。此剂量一次给药对实验动物的体重增长、脏器系数(脏器 体重比)以及反映肝肾功能的主要生化指标均未见有明显的影响。属于实际无毒性物质，表明该连翘叶急性毒性极低，临床应用较为安全，有广阔的开发应用前景。 本实验结果同以往文献报道结果近似[3]，也有不同的实验结果报道[4]，究其原因，可能是因连翘叶提取物制备方法的不同造成的差异。

据文献报道，连翘叶具有多方面的药理作用[5]。连翘叶所含化学成分的研究表明，连翘叶里含有连翘苷、连翘酯苷、芦丁、右旋松脂酚等化学成分，与连翘果实十分类似，而且连翘叶里相关成分的含量远高于连翘果实，其中连翘苷含量差别约10倍以上[6]，连翘酯苷差别约5～10倍[7]。

由于连翘苷、连翘酯苷、芦丁、三萜类等成分被认为是中药连翘中的活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抑制弹性蛋白酶等多种活性，所以连翘叶也可能具有连翘药材同样的药理活性，且毒性较低，使用安全。同时由于连翘叶资源丰富，产量受气候条件影响较小等原因，所以具有良好的开发应用前景。

[1] 张海燕.连翘化学成分及药理活性研究进展[J].中药材,2000,23(10): 657-660.

[2] 曲欢欢，翟西峰，孙文基，等．连翘不同部位中连翘酯苷和连翘苷的含量分析[J].药物分析杂志，2008,28(3):382-385.

[3] 艾 霞，董雪婷，王丽洁，等.连翘叶水提取物对小鼠急性毒性和微核试验[J].安徽农业科学,2011,39(11):6397-6398.

[4] 李 晓，郭 唯，陈 飞，等．连翘叶不同提取物急性毒性实验研究[J].饲料研究，2013(1):11-12.

[5] 薛愧玲,袁王俊.连翘叶的药理研究综述[J].时珍国医国药,2009,20(5):1149-1150.

[6] 丁 冈，刘延泽.中药连翘及其同属植物研究近况[J].中药材，1994,17(10):42-44.

[7] 靖 会，李教社，曹 蔚，等.高效液相色谱法测定连翘中连翘酯苷的含量[J]. 西北药学杂志，2003,18(4)：156-157.

本文编辑：王知平

Study on Acute Toxicity of Extract of Forsythia Suspensa Leavies in Mice

HOU Sufang1，SHI Xianghua2，CHAI Qiuyan2

(1.ChineseMedicineSchoolinShanxiProvince，Taiyuan030012，Shanxi，China；2.ShanxiAcademyofMedicalandLifeSciences，Taiyuan030006，Shanxi，China)

Objective:To study the acute toxicity of the extract of forsythia suspensa leavies in mice, and to make sure the safety of clinical application. Methods:The animal reactions and death rate were observed according to the indexes in the acute toxicity test. The half lethal dose (LD50) and the maximum tolerance dose (MTD) were recorded in the pre-experiment to determine the initial dose.The mice were grouped randomly in the formal experiment,Which were recorded for 14 days. The ALT、AST、CER、BNU and body weight were measured. Results:Based on the acute toxicity test，studying something about behavioral characteristics，weight，pathological anatomy of visceral organs，hematological indexes and biochemical indexes, the maximum amount of observation was 61.60 g/kg．There were no toxicity reactions shown during the observed period．There was no statistically significant difference(P>0.05). Conclusions:The toxicity of forsythia suspensa leavies is smaller. The data of the clinic practice can be provided to improve the safety. of dinical application.

mice；acute toxicity;forsythia suspensa leavies; extract

侯苏方，女，助讲，从事药理学教学与研究工作

R965.3

A

1671-0126(2016)05-0001-04