胃癌根治术后患者血循环肿瘤细胞的检测及其意义

狄剑士，郑桂丽，李梦岩，李锴男，王宝成

胃癌根治术后患者血循环肿瘤细胞的检测及其意义

狄剑士，郑桂丽，李梦岩，李锴男，王宝成

胃癌；循环肿瘤细胞；根治术后

胃癌目前仍是我国发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一，5年生存率仅为10%左右，其术后复发和转移是死亡的主要原因［1］。 循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是发生微转移的必要步骤［2］，与肿瘤血液转移有密切相关性，提示在常规的影像学诊断之前可能已有肿瘤微转移灶的发生。2013年10月—2014年4月笔者利用免疫磁珠阴性富集法对60例胃癌患者术后外周血中的CTCs进行检测，并讨论CTCs与临床分期的相关性。

1 资料与方法

1．1 一般资料60例胃癌首次根治术后未行化疗患者。男37例，女23例；年龄36～83岁，中位年龄58岁。乳头状腺癌 14例，管状腺癌 7例 ，黏液腺癌 4例，印戒细胞癌 6例 ，低分化腺癌17例，未分化癌12例。根据TNM分期分为Ⅰ期11例，Ⅱ期21例，Ⅲ期28例。

1．2 方法所有研究对象均采用真空采血管采集肘正中静脉血3．2 ml（不含抗凝药）于ACD抗凝管中。采用免疫磁珠富集技术分离CTCs，用荧光原位杂交和免疫荧光染色鉴别CTCs，在荧光显微镜下观察并统计CTCs。判读标准为DAPI+（单核），细胞核内FISH信号点＞2个，且无血源性白细胞表面抗原着色，即CD45-。外周血中CTCs计数＞2个／3．2ml定义为CTCs阳性。同时随访患者术后2年的病情变化。

1．3 统计学方法采用SPSS 17．0统计学软件分析，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期各组间的CTCs阳性率、血液转移比较，采用χ2分析，以P＜0．01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床分期胃癌患者术后CTCs检测结果比较60例胃癌根治术患者外周血中CTCs阳性率为43．3%（26／60），分别为Ⅰ期9．1%（1／11），Ⅱ期为33．3．%（7／21），Ⅲ期为64．3．%（18／28），Ⅲ期阳性率与Ⅰ期、Ⅱ期相比较，差异具有统计学意义（P＜0．01）。见表1。

2.2 不同临床分期胃癌患者术后2年复发转移结果比较60例胃癌根治术外周血中CTCs阳性患者，Ⅰ期CTCs阳性患者2年内未转移；Ⅱ期CTCs阳性患者6～12个月无转移，12～24个月出现转移4例，其中肝转移2例，肝肺同时转移1例，骨转移1例；Ⅲ期CTCs阳性患者6～12个月内肝转移1例，12～24个月出现转移8例，其中肝脏转移2例，肝、肺和骨同时转移3例，骨转移1例，肺和颅内转移分别1例。转移率Ⅲ期高于Ⅱ期和Ⅰ期，差异有统计学意义（P＜0．01）（表2）。

表 1 不同临床分期胃癌患者术后CTCs检测结果的比较

表 2 不同临床分期胃癌患者术后2年复发转移结果的比较

3 讨论

澳大利亚的Ashworth于1869年首次提出循环肿瘤细胞的概念，循环肿瘤细胞（CTCs）是指恶性肿瘤从原发灶和或转移灶脱落进入血液循环的肿瘤细胞。CTCs来源于实体瘤，通过基因转录、蛋白修饰和细胞表型的改变增强其侵袭力，再经过诱发新生血管生成或经周围血管系统进入循环系统，上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在此环节中发挥重要的作用［3］。进入血液循环的肿瘤细胞大部分发生凋亡或被机体自身免疫系统吞噬及血液的剪切作用而死亡，也可被抗肿瘤治疗清除，仅有少数的CTCs能成活下来，形成新的转移灶。所以发现CTCs并不能证明一定有转移灶形成，根据估计，仅有0．1%的CTCs会形成转移灶［4］。由于CTCs的检测技术没有取得突破性进展，所以其检测并未在肿瘤的防治中发挥应有的作用。随着CTCs检测技术的不断成熟，美国FDA于2014年批准了 BioTNT公司的Cellsearch系统在转移性结直肠癌、乳腺癌和前列腺癌中的应用。由于相当一部分肿瘤患者术前已经出现肿瘤微转移灶，但常规传统的影像学检查无法发现，CTCs检测有助于发现早期患者的微转移灶，Sastre等［5］发现CTCs与直结肠癌的临床分期相关，且能在早期的直结肠癌患者体内检测到，提示检测CTCs有助于早期发现肿瘤。由于CTCs在外周血中数量较少，所以从血液中分离富集CTCs是进行检测的关键。目前用于CTCs的富集的方法主要有：梯度离心法、过滤法、免疫磁珠分选法。检测方法主要有免疫细胞化学法、流式细胞检测法、聚合酶链式反应核酸扩增法、光纤阵列扫描术、酶联免疫斑点术、CTC芯片技术等。

该研究采用免疫磁珠阴性富集法进行富集，通过去除血浆，裂解红细胞，利用表面包被磁珠的抗白细胞共同抗原的抗体去除白细胞，从而富集得到稀有细胞，最后进行免疫荧光染色在荧光显微镜下进行鉴定判读。CTCs检测有助于TNM分期［6］，但也有学者认为与TNM分期无关，而与胃癌淋巴结转移、远处转移和复发密切相关［7］。本组60例应用上述方法检测胃癌根治术患者外周血中CTCs阳性率为43．3%，Ⅲ期患者阳性率高于Ⅰ期、Ⅱ期 （P＜0．01），提示与肿瘤TNM分期密切相关。CTCs阳性患者出现远处转移机率明显增加，CTCs阳性患者转移率Ⅲ期高于Ⅱ期和Ⅰ期，差异有统计学意义（P＜0．01），分期越晚，CTCs阳性患者远处转移的风险更高，说明CTCs检出与胃癌的预后密切相关。因此对于原发性胃癌CTCs检测对于早期预测转移，TNM分期及预后评价具有重要意义。检测CTCs可早于常规影像学检查评估肿瘤复发风险，判断患者预后，指导术后辅助化疗和肿瘤的个体化治疗。这对于降低术后肿瘤复发及转移率，提高生存率具有重要的意义。

［1］Zhang ZY，Ge HY．Micrometastasis in gastic cancer［J］．Cancer Lett，2013，336（1）：34-45．

［2］Maestro LM，Sastre J，Rafael SB，et al．Circulating tumor cells insolid tumor in metastatic and localized stages［J］．Anticancer Res，2009，29（11）：4839-4843．

［3］Kalluri R，Weinberg RA．The basics of epithelial-mesenchymal transition［J］．J Clin Invest，2009，119（6）：1420-1428．

［4］Liotta LA，Stetler-Stevenson WG．Tumor invasion and metastasis：an imbalance of positive and negative regulation［J］．Cancer Res，1991，51（18S）：5054-5059．

［5］Sastre J，Maestro ML，Puente J，et al．Circulating tumor cells in colorectal cancer：correlation with clinical and pathological variables［J］．Ann Oncol，2008，19（5）：935-938．

［6］黄选章，王振宁．循环肿瘤细胞对胃癌临床病理特点和预后意义的Meta分析［C］．第9届全国胃癌学术会议暨第二届阳光长城肿瘤学术会议论文集，2014：6．

［7］李 熳，张志广，刘 霞，等．胃癌患者循环肿瘤细胞的检测及临床意义［J］．中国肿瘤临床，2014，41（22）：1142-1145．

［2015-09-14收稿，2015-10-12修回］ ［本文编辑：吴 蓉］

R735．2

B

10．14172/j．issn1671-4008．2016．03．022

250031山东济南，济南军区总医院肿瘤科（狄剑士，郑桂丽，李锴男，王宝成）；264000山东烟台，解放军71146部队烟台第一干休所卫生所（李梦岩）