印度黄檀茎段腋芽诱导培养研究

杜 婷，牛慈琼，石 雷*，廖怀建

(1.中国林业科学研究院资源昆虫研究所，云南 昆明 650224；2.山西省农业科学院果树研究所，山西 太原 030031)

印度黄檀茎段腋芽诱导培养研究

杜 婷1，牛慈琼2，石 雷1*，廖怀建1

(1.中国林业科学研究院资源昆虫研究所，云南 昆明 650224；2.山西省农业科学院果树研究所，山西 太原 030031)

为建立有效的印度黄檀组培快繁技术，本研究采用优树嫁接苗的腋芽茎段作为外植体，阐明不同消毒方法、不同基础培养基、不同植物生长调节剂和活性炭浓度对诱导培养的影响，以期为获得能够保持母株优良性状的无性系苗木奠定基础。结果表明，最佳的消毒方法是，外植体先用75%酒精浸泡30 s，然后用0.1 %升汞浸泡10 min，此时污染率最低，腋芽萌发率最高，污染率和存活率分别为(16.67±2.03)%和(70.33±2.03)%；相对于B5和WPM基础培养基，使用MS培养基对外植体进行培养，萌芽率和苗高最高，分别为(85.00±2.89)%和(22.03±0.09)mm；培养基中植物生长调节剂6-BA和NAA的浓度及两者浓度比率均对腋芽诱导产生显著影响；当NAA浓度(0.01～0.02 mg/L)较低时，在0.2～0.3 mg/L范围内提高6-BA的浓度有利于植株生长，且两者浓度比率达到20～30时，最适宜腋芽诱导；在最适激素浓度条件下，添加0.5 g/L活性炭，能够有效提高外植体萌芽率，降低玻璃化率。综上所述，印度黄檀茎段腋芽诱导的最适培养基为MS+0.3 mg/ L 6-BA+0.01 mg/L NAA+0.5 g/L。

印度黄檀;消毒;腋芽;诱导培养

印度黄檀(DalbergiasissooRoxb)属蝶形花科(Fabaceae)黄檀属(Dalbergia)多用途速生木本植物,主要分布于印度、巴基斯坦和尼泊尔等国家[1-2]。印度黄檀木材具有优良的坚固性和弹性，可用于制作家具、橱柜、乐器和胶合板；而根、干和叶均可入药，且性辛、温，有活血行淤，止血止痛的功效，主治风湿性腰腿痛、支气管炎、跌打肿痛、胃痛、疝气痛、冠心病等[3]。印度黄檀不仅木材和药用价值非常高，而且耐干旱耐脊薄，是一种值得推广的珍贵树种[4]。印度黄檀常规的繁殖方式，一般通过种子进行有性繁殖，或者吸根、茎段扦插进行无性繁殖[5]。通过有性繁殖产生的子代，苗木参差不齐，无法保持母株的优良特性[6]；通过扦插或嫁接等无性繁殖方法进行繁殖，费时费力，且繁殖系数较低，严重影响良种推广进程；而采用组织培养快繁技术，可在短时间内获得大量保持母株优良性状的无性系苗木，能够满足规模化造林对印度黄檀优良种苗的需求。目前在印度黄檀组织培养方面，国外已有很多采用组织培养方法获得再生植株的成功案例，主要有2种方法：利用子叶[7]、茎段[8]或悬浮细胞[9]培养得到的愈伤，进一步诱导获得再生芽；直接利用茎段[10-12]诱导腋芽得到再生芽，最终通过再生芽增殖获得再生植株。不过，国内针对印度黄檀离体培养至今鲜见报道。因此，本研究以印度黄檀嫁接苗的茎段作为外植体，探索适合腋芽诱导的培养基配方，旨在为印度黄檀组培快繁体系的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

外植体于2014年3-6月采自中国林业科学研究院资源昆虫研究所元江试验站印度黄檀采穗圃中优树嫁接苗。

1.2 不同消毒方法对外植体污染的影响

选取生长健壮，无病虫害植株的当年生幼嫩枝条，去除叶片，流动清水洗去表面尘垢后，将幼嫩枝条剪成长为3～4 cm含腋芽的茎段。置于盛有1 000 mL洗衣粉溶液的烧杯中浸泡20 min后，用纱布封住烧杯口，以流动清水冲洗30～60 min，在无菌条件下消毒处理。

外植体的消毒方法见表1。选取3种较常用的消毒剂：2 %的次氯酸钠、75 %的酒精、0.1 %升汞溶液。茎段消毒方法主要有2种：将清洗过的外植体置于盛有2 %次氯酸钠溶液的烧杯中浸泡5 min后将外植体分别置于盛有0.1 %升汞溶液烧杯内浸泡8、10和12 min，重复3次，每个重复有20个茎段；将清洗过的外植体分成3份分别先置于75 %酒精中浸泡20、30和40 s，重复3次，每个重复有20个外植体，然后置于盛有0.1 %升汞溶液的烧杯内浸泡10 min后，将外植体用无菌水冲洗5～6次。然后接种到添加有植物生长调节剂0.3 mg/L 6-BA、0.01 mg/L NAA，蔗糖30 g/L和琼脂粉7 g/L，pH值为6.0的MS培养基中，置于温度(26±2)℃、光照强度1500 lx，光照时间12 h/d的条件下培养。于培养第10天查看外植体污染情况，并记录污染数量，以此计算污染率；并于培养第20天查看外植体存活数量，以此计算存活率。

1.3 不同培养基对外植体萌芽的影响

1.3.1 基础培养基对外植体萌芽的影响 选取木本植物组织培养中常用的MS、B5和WPM 3种基础培养基。选取经75 %酒精浸泡30 s后，0.1 %升汞浸泡10 min方法消毒的外植体分别培养于MS、B5和WPM培养基中，置于温度(26±2) ℃、光照强度1500 lx，光照时间12 h/d的条件下培养，每种培养基3个重复，每重复20个外植体。在培养后每隔2 d观察1次，查看外植体芽苗生长情况剔除污染的外植体，第20天记录萌芽的外植体数量，计算萌芽率，同时测量芽苗长度。

1.3.2 诱导培养基对外植体萌芽的影响 以MS为基础培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂(6-BA：0.1、0.2、0.3 mg/L；NAA：0.01、0.05、0.07 mg/L)进行外植体诱导培养，诱导培养条件参见1.3.1，具体浓度配比试验设计见表4，每个处理3个重复，每个重复20个外植体。在培养后每隔2 d观察1次，查看外植体芽苗生长情况剔除污染的外植体，第20天记录萌芽的外植体数量，计算萌芽率，同时测量芽苗长度。

表1 外植体消毒方法

表2 外植体各种消毒组合试验效果

注：数据为平均值±标准误，同列数据后的大写字母不同表示差异显著。下同。

Notes:Data were mean±SE, which followed by different capital letters in the same column indicate significant difference. The same as below.

1.3.3 抗玻璃化培养基对外植体萌芽的影响 以MS为基础培养基，添加不同浓度的植物生长调节剂(6-BA：0.1、0.2、0.3 mg/L；NAA：0.01、0.02、0.03 mg/L)及抗玻璃化添加剂(活性炭：0、0.5、1.0 mg/L)，采用3因素3水平的正交设计，具体试验设计见表5，培养条件参见1.3.1。每个处理3个重复，每个重复20个外植体。在培养后每隔2 d观察1次，查看外植体芽苗生长情况剔除污染的外植体，第20天记录萌芽的外植体数量，计算萌芽率，同时测量芽苗长度。

所有培养基中均添加蔗糖30 g/L和琼脂粉7 g/L，调节pH值为6.0，并在121 ℃、131 kPa条件下灭菌20 min。

1.4 数据分析

经不同消毒方法消毒后及不同培养基培养后的外植体萌芽率、存活率和玻璃化率均代入sqrt(x+1)进行转换，使其尽量符合正太齐性，然后采用单因素方差检验不同消毒方法以及不同培养基间的差异，若差异达到显著水平，则采用Duncan's multiple-range test方法进行检验。不同培养基培养后的外植体苗高的差异采用单因素方差分析方法检验，差异达到显著水平，则采用Duncan's multiple-range test方法检验。采用所有数据分析均在SAS 9.0中进行。

2 结果与分析

2.1 不同消毒方法对外植体污染的影响

不同消毒方法显著影响外植体的污染率和存活率(表2)。经S1和S4消毒方法消毒的外植体污染率最高，分别为(40.33±2.03)%和(33.33±1.76)%，其它消毒方法间无显著差异(F5,12=4.52,P=0.015)。经S5消毒方法消毒的外植体存活率最高，其次为S4、S2和S6，最差的是S1和S3(F5,12=3.74,P=0.015)。综合显示，经不同消毒方法消毒后外植体的污染率和存活率，S5消毒方法表现最优，其次为S6。采用75 %酒精浸泡30 s后，0.1 %升汞浸泡10 min的方法消毒印度黄檀外植体。

2.2 基础培养基对外植体萌芽的影响

基础培养基显著影响外植体的腋芽诱导(表3)。经MS培养基培养后外植体的萌芽率和苗高均显著提高(萌芽率：F2,6=18.57,P=0.0027；苗高：F2,177=72.41,P<0.0001)，分别为(85.00±2.89)%和(22.03±0.09)mm；此时，生长出的新芽健壮，新叶嫩绿，且叶片伸展正常；经WPM培养基培养后外植体的萌芽率表现最差，为(61.67±1.67)%，此时新芽细弱，新叶发黄，且叶片细小；B5培养基居于中间，不过其生长的新芽细弱，叶片伸展虽然正常，但新叶发黄(表3)。综上表明，经MS基础培养基培养的外植体表现最好，适合作印度黄檀外植体培养的基础培养基。

表3 不同基础培养基对外植体生长的影响

表4 不同植物调节剂配比对诱导培养的影响

2.3 诱导培养基对外植体萌芽的影响

不同浓度生长调节剂及配比显著影响外植体的腋芽诱导(表4)。经C3培养基培养后的外植体的萌芽率和苗高均显著提高(萌芽率：F4,10=63.77，P<0.0001；苗高：F4,295=65.97，P<0.0001)，分别为)(84.33±0.67)%和(22.9±1.20)mm；其次为C2和C5，最差的是C1。另外根据植株生长显示，过高浓度的6-BA和NAA配合会导致植株出现玻璃化、发黄落叶的现象。综合考虑，处理C3最利于印度黄檀的诱导培养，但绝大多数植株有玻璃化现象，需要进一步筛选印度黄檀诱导培养阶段的抗玻璃化培养基。

2.4 抗玻璃化培养基对外植体萌芽的影响

抗玻璃化添加剂活性炭显著缓解了诱导出的芽苗的玻璃化状况(表5)。经V4培养基培养后的外植体萌芽率最高(F8,18=1153.23，P<0.0001)，为(100±0)%，其次为V5、 V6和V7，最差的是V3。经V4培养基培养后的芽苗玻璃化率(F8,18=197.10，P<0.0001)最低，为(5.17±0.44)%，V2和V3表现次之，V6表现最差；经V2培养基培养后的苗高显著提高(F8,531=142.67，P<0.0001)，为(26.40±0.21)mm，其次为V1和V4，最差的是V5。综合显示，经不同培养基诱导后外植体的萌芽率、玻璃化率和苗高，V4表现最优，因此V4培养基即MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.02 mg/L+C 0.5 g/L可作为印度黄檀外植体诱导的培养基。

3 讨 论

无菌外植体是离体快繁体系建立的基础，外植体的表面消毒既要求将外植体表面的微生物彻底杀死，又要求尽可能减少对外植体组织和表皮细胞的伤害。单独使用一种消毒剂很难获得较好的消毒效果，即使杀毒效果最好的升汞单独使用2～8 min，污染率仍在60 %以上[13]，在花梨木茎段腋芽诱导培养中，林妃[14]采用单一一种消毒剂进行试验，得到的最佳消毒方法：0.2%升汞处理，污染率高达54.2 %；10 %次氯酸钠处理，污染率为44.3 %。有研究者对辣木[15]、油茶[16]等茎段外植体消毒试验中采用酒精和升汞的组合能将污染率控制在30 %以下，因此采用消毒剂的组合处理外植体能达到更好的消毒效果。本研究通过3种不同消毒剂组合消毒，筛选出印度黄檀外植体消毒的最佳方法是：将外植体先用75 %酒精浸泡30 s，利用酒精渗透压吸收细菌水分，使其快速失水死亡；然后再用0.1 %升汞浸泡10 min，升汞中所含重金属离子可使含有巯基、氨基、羟基的酶受到损伤，甚至失去活性，丧失功能，从而杀死外植体表面细菌，在培养后第10天观察到外植体污染率为(16.67±2.03)%，存活率高达(70.33±2.03)%。

表5 不同植物调节剂和添加剂配比对诱导培养的影响

植物生长调节剂对器官的分化调节起重要作用，NAA能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定芽；6-BA能促进芽的分化、侧芽的生长[19]，而细胞分裂素和生长素的配比是诱导器官发生的关键因子[20]。本试验中，不同生长调节剂具有明显促进腋芽萌发的作用，且浓度和浓度比率不同，诱导效果存在显著差异。保持NAA浓度(0.01～0.02 mg/L)较低时，在0.2～0.3 mg/L内提高6-BA的浓度有利于植株生长。在囊状紫檀[19]、紫薇[20]、印度黄檀[21]等木本植物的研究中也得到了相同的结论，低浓度生长激素与细胞分裂素的配合可促进再生芽的生长。此外，芽的诱导不仅仅取决于生长调节剂的浓度，还与细胞分裂素和生长素浓度的比率有关，比率达到适宜范围内，才能使萌芽率提高。当6-BA/NAA比率在20～30时，印度黄檀外植体的腋芽萌发率较高，此时苗高也显著高于其它6-BA/NAA比值。同时，在阔叶黄檀[17]、美国黑核桃[22]和臭椿[23]等植物的茎段腋芽诱导试验中也得到了相似的结果。

玻璃化现象主要出现在植物培养的增殖阶段，诱导阶段很少会出现玻璃化的现象。植物组织培养过程中出现玻璃苗的现象很普遍，目前已报道出现玻璃化的植物达70多种[24]。一些研究者在罗汉果[25]和蓝莓[26]的增殖培养中发现，在培养基中添加了0.5 g/L活性炭，能够促进壮苗生长和玻璃化缓解。本研究发现将活性炭添加培养基，在诱导过程中，能够有效缓解玻璃化现象的产生，在适宜外源激素浓度下，腋芽诱导和生长的最适活性炭浓度为0.5 g/L。不过，外源激素水平过高，高浓度的活性炭反而会诱发玻璃化现象的产生。因此使用活性炭缓解玻璃化，应该在适宜的激素浓度下，采取适宜活性炭浓度，才能最大程度的提高外植体的萌芽率，降低玻璃化率。

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(责任编辑 王家银)

Study on Axillary Buds Induction from Stem Segments ofDalbergiasissooRoxb

DU Ting1, NIU Ci-qiong2, SHI Lei1*, LIAO Huai-jian1

(1.Research Institute of Resource Insects, Chinese Academy of Forestry, Yunnan Kunming 650224, China;2.Research Institute of Fruit Tree, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Shanxi Taiyuan 030031, China)

In order to establish effective rapid propagation technique forDalbergiasissooRoxb, axillary buds from stem segments of selected tree grafted seedlings were used as explants in this paper. Effects of different disinfection methods, different basic medium component, and different concentration of plant growth regulator and the activated carbon on its germination of axillary buds were studied for attaining clone seedlings maintained mother plants’ excellent characters. The results showed that the time of 75 % alcohol disinfection was 30 seconds and the time of 0.1 % HgCl2disinfection was 10 minutes, in this treatment, the lowest pollution rate was (16.67±2.03)% and the highest germination rate of the bud was (70.33±2.03)%. Compared with B5and WPM, MS was the optimal culture medium with the highest germination rate (85.00±2.89)%and seedling height(22.03 mm±0.09 mm). The concentration and proportion of 6-BA and NAA had the influence on the explants bud induction. When the concentration of NAA was low (0.01-0.02 mg/L), increasing 6-BA concentration in the range from 0.2 to 0.3 mg/L was beneficial to plant growth. And the proportion of 6-BA and NAA in the range from 20 to 30 was advantageous to the axillary bud induction. Under the condition of the optimal concentration of plant growth regulator, adding 0.5 g/L activated carbon in the medium could effectively improve the germination rate of explants and reduce the rate of vitrification. In conclusion, this study suggested that the medium composition of MS+0.3mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA+0.5g/L was the optimum for axillary buds induction from stem segments ofDalbergiasissooRoxb.

DalbergiasissooRoxb; Sterilization methods; Basal medium; Axillary buds induction; Vitrification

1001-4829(2016)12-2959-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.034

2016-01-05

国家科技支撑计划项目(2012BAD01B05)；国家重点研发计划项目(2016YFD06006005)

杜 婷(1988-)，女，白族，云南丽江人，硕士，助理研究员，主要研究方向为植物组培，E-mail：duting_x_y@163.com，*为通讯作者，E-mail：leishi@139.com。

S772.3+7

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