利用标记辅助选择培育抗褐飞虱水稻三系保持系和不育系

郭 辉，冯 锐，陈 灿，张晓丽，刘百龙，秦学毅

(广西农业科学院水稻研究所/广西水稻遗传育种重点实验室，广西 南宁 530007)

利用标记辅助选择培育抗褐飞虱水稻三系保持系和不育系

郭 辉，冯 锐，陈 灿，张晓丽，刘百龙，秦学毅*

(广西农业科学院水稻研究所/广西水稻遗传育种重点实验室，广西 南宁 530007)

以广西普通野生稻的高抗褐飞虱渗入系HS204为抗源供体材料，采用杂交、回交，结合分子标记辅助选择的方法，选育抗性保持系和不育材料，以期为杂交稻抗性育种提供良好的材料基础。结果表明，通过标记辅助选择获得4份抗性基因纯合的保持系中间材料(100B、101B、102B和103B)，2份抗性不育系材料(100A和103A)。与高抗不育系100A测交的10个组合均表现出较好的抗褐飞虱抗性水平，其中属高抗水平的为100A/R2586、100A/KR838和100A/KR527，其余为抗至中抗水平；100A/KR527、100A/R2586、100A/明恢63、100A/辐恢838和100A/桂99等组合单株产量比对照(特优7118)显著增高，增幅为14.45 %～49.26 %。获得的抗性保持系，可为杂交稻抗性不育系的育种提供更好的基因源；获得的抗性不育系可直接应用于三系杂交稻的配组选育。

水稻；抗褐飞虱品种；分子标记辅助选择；保持系；不育系

(Rice Research Institute/Guangxi Key Laboratory of Rice Genetics and Breeding, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Guangxi Nanning 530007，China)

稻褐飞虱[Nilaparvatalugens(Stål)]，属于同翅目飞虱科(Homoptera:Delphacidae)，是我国南方稻作区及东南亚水稻生产国的主要害虫之一[1]，由于褐飞虱繁殖力强、生长周期短、有很强的适应力和远距离迁飞性等特点，同时还是水稻病毒如草状矮缩病毒的传播媒介，因此可对水稻正常生长产生极大危害[2]。2001-2010年，我国因褐飞虱危害，每年平均受灾稻田约2467×105hm2次，造成稻谷损失年均1.12亿kg，分别比1990-2000年均值增加47.2 %和46.0 %[4]。目前，对褐飞虱防治仍以化学药剂防治为主[5]，不仅增加稻米生产成本、污染环境，且部分杀虫剂还可刺激褐飞虱产卵，诱导其产生抗药性[6]。有关研究结果表明，挖掘和利用抗褐飞虱基因，选育和推广抗褐飞虱水稻品种是控制褐飞虱种群最节约成本、安全、有效的途径之一[7]。

抗性基因的鉴定与定位是抗性育种的基础，迄今至少报道了34个褐飞虱抗性位点，其中28个主效抗性基因已被定位，其中显性基因Bph3、Bph14、Bph26和隐性基因bph29已被成功克隆[8-9]，这些基因中的一小部分已应用于抗褐飞虱遗传改良。由于抗虫鉴定受环境的影响较大，且耗时费力。而分子标记辅助选择不受虫源的影响，结合常规育种手段，已成为抗褐飞虱选育的重要途径[10-11]。采用来源于广西普通野生稻的高抗褐飞虱渗入系HS204为抗源，通过杂交、回交，结合分子标记辅助选择将抗性基因转入保持系龙特甫B中，再与龙特甫A测交、回交，选育抗性不育系材料，以期为杂交稻抗性育种提供良好的材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供体亲本为高抗褐飞虱材料HS204，其抗褐飞虱基因来源于广西普通野生稻，为经多年杂交选育而成的近等基因系。受体亲本为水稻三系保持系龙特甫B。Ptb33为抗虫对照(CK-R)，TN1为感虫对照(CK-S)。用于测交的恢复系：桂99、明恢63、中恢6号、盐恢559、R7954和辐恢838，自育恢复系：R2586，自育抗褐飞虱恢复系KR838、KR527、KR30等。

供试虫源为广西南宁田间采集混合生物型，在网室用TN1饲养繁殖备用，以褐飞虱生物型Ⅱ为主，与部分越南九龙江型、孟加拉型和生物型Ⅰ构成混合生物型。

1.2 检测分子标记

将抗源HS204的抗褐飞虱基因定位在第4号染色体分子标记M4-10与M4-68间，其中SSR标记M4-10在2个亲本间表现多态，参照CTAB提取法从水稻叶片中提取DNA样品，利用与抗褐飞虱基因紧密连锁的分子标记M4-10(F：5′-GTGTAGCTGCTAGGCCGAAC-3′；R：5′-TTCCTTTCGCTACGTTGGAC-3′)，对分离群体中的抗性基因Bph(t)进行跟踪检测，选择携带目标基因的株系。

分子标记引物由北京三博远志公司合成，DNA聚合酶、dNTPs等试剂购自上海生工生物工程技术公司。水稻PCR扩增，电泳及银染检测参考李进波等[10]的方法，PCR扩增总体积为10 μl，反应体系含有10×PCR Buffer(含Mg2+)1 μl，10 mM dNTP 0.2 μl，5 U/μlTaqDNA polymerase 0.1 μl，10 μM上游、下游引物各0.2 μl， DNA模板1 μl，ddH2O调至总体积10 μl。

1.3 鉴定褐飞虱抗性

参照苗期集团筛选法[12]，将待鉴定品系每份取适量种子，催芽后条播于盘内，每行播20～25粒，当苗长至2～3叶时去除小苗、弱苗，保留健壮一致的苗，按每株5～8头接入2～3龄若虫，在感虫对照品种TN1死亡7 d后进行调查。抗虫级别按国际水稻所标准逐株评定：1级，不受损害或第1叶梢变黄；3级，第1、2叶黄；5级，第1～3叶变黄或植株呈矮化；7级，植株开始凋萎；9级，植株死亡。最后计算各品系平均抗性级别，公式如下：平均抗级=∑(各抗级株数×对应抗性级别)/总株数。平均抗性级别分为：1.0～1.9为高抗(HR)，2.0～3.9为抗(R)，4.0～5.9为中抗(MR)，6.0～7.9为中感(MS)，8.0～9.0为高感(HS)。

1.4 测定测交组合农艺性状

用转育得到的抗性不育系与恢复系分别测交，特优7118作为对照，每个小区1个组合按5行×10株规格种植，3次重复，田间数据对每小区第3行3～8株进行采集，主要指标有株高、有效穗数、穗长、每穗粒数、结实率、千粒重等产量相关性状。

2 结果与分析

2.1 改良选育抗褐飞虱保持系

于2011年早造采用龙特甫B作母本，抗褐飞虱HS204作父本进行杂交，同年晚造再利用龙特甫B作轮回亲本进行回交。于2012年早造利用与抗性基因紧密连锁的标记M4-10和M4-68进行检测，选择含目的基因的单株再次回交，之后结合分子标记辅助选择、苗期抗性鉴定和田间农艺性状观测，选择符合育种目标的单株自交，目前已获得4份抗性基因纯合的保持系中间材料，分别为100B、101B、102B与103B。图1显示的是利用标记检测改良龙特甫B分离群体中随机选取的28个单株。

2.2 选育抗褐飞虱不育系

为了缩短育种时间，从2013年晚造开始对BC2F3代改良的保持系株系进行不育性保持能力的测配筛选。利用待改良保持系对应的龙特甫A测交，下一造选择不育率达99.99 %以上的株系，从中进行分子标记检测，选择农艺性状良好的抗性株系连续回交，至2016年早造获得BC5F1代的抗性不育系材料100A、103A，同时获得BC2F8代的抗性保持系100B、103B。

2.3 改良保持系及测交组合的抗褐飞虱抗性鉴定

经过连续多年选育，至2015年改良抗性保持系已到BC2F7世代，农艺性状基本稳定。在2014和2015年连续2年的苗期抗性鉴定中(表1和图2)，改良保持系100B、103B的抗级都小于2级，达高抗水平。这表明所选育的改良保持系100B、103B对褐飞虱具有稳定的抗性，并且经多代自交后农艺性状也基本稳定。

M：DL500 DNA Marker；P1：供体亲本HS204；P2：受体亲本龙特甫B；1～28：BC2F2分离世代图1 分子标记M4-10检测BC2F2代单株部分结果Fig.1 Detection of molecular marker M4-10 in partial individuals of BC2F2 population

年份Year品系Lines苗数Seedlingnumbers抗性级别Resistancegrades13579平均抗级Averageresistantgrades2014100B382980011.63103B4023170001.85CK-R201421032.60CK-S180000189.002015100B372890001.49103B4328150001.70CK-R211421132.81CK-S200000209.00

由改良的抗性保持系回交转育的抗性不育系100A，与恢复系测交组合的苗期抗性鉴定结果可知(表2)，不育系100A对褐飞虱已接近高抗水平，其测交组合均表现出不同的抗性水平，其中与恢复系桂99、明恢63、中恢6号、盐恢559、R7954(序号1～5)的测交杂种均达到抗性水平，与恢复系R2586(自育)的测交种接近高抗水平，与辐恢838的测交种为中抗水平。与自育的抗性恢复系KR838、KR527、KR30(序号8～10)的测交杂种的抗性级别均小于3，且2个抗级达高抗水平。而自育的不育系创ⅠA(对褐飞虱高感)与明恢63、中恢6号(序号11～12)的测交杂种对褐飞虱均表现为高感。这些组合不同的抗性水平说明该抗性基因在不同的杂交稻背景下都能有效表达，而抗性水平不同说明在不同背景下，抗性的表达存在差异，另外亲本双方都含有抗性，能有效提高杂交组合的抗性水平。

图2 改良保持系材料抗褐飞虱鉴定Fig.2 BPH resistance identificationof improved maintainer lines

2.4 测配组合的农艺性状比较

从改良抗性不育系100A与10个恢复系测交组合的农艺性状(表3)可以看出，10个组合中仅组合100A/桂99单株有效穗数显著超过对照；除100A/盐恢559与对照差异不显著外，其余组合每穗实粒数均显著或极显著高于对照；除100A/中恢6号、100A/盐恢559和100A/辐恢838与对照差异不显著外，其余组合千粒重均显著或极显著小于对照；100A/KR527、100A/R2586、100A/明恢63、100A/辐恢838和100A/桂99等组合单株产量显著高于对照，增幅为14.45 %～49.26 %；说明在同样的种植条件下，多数组合具有较好的产量水平。

表2 测配组合的苗期褐飞虱抗性鉴定结果

表3 测配组合农艺性状表现

注：*表示0.05水平差异显著；**表示0.01水平差异显著。

Note:*represented significant difference at 0.05 level, ** represented significant difference at 0.01 level.

3 讨论与小结

如今，分子标记辅助选择已广泛应用于水稻抗性育种，且成功培育了一大批优良抗病虫品系，如刘开雨等[13-14]通过回交、分子标记辅助选择和接虫鉴定三者相结合的办法，将抗稻褐飞虱基因Bph3和Bph24(t)分别导入主栽杂交水稻恢复系广恢998、9311、R15、明恢63、R29中；另外采用同样的方法获得抗稻白叶枯病和稻褐飞虱的抗性基因Xa21Xa23Bph24(t)聚合系2个和Xa23Bph24(t)聚合系4个，双抗性聚合系对稻白叶枯病达到高抗水平，对稻褐飞虱的抗性接近高抗水平；胡杰等[15]利用分子标记辅助选择把抗褐飞虱基因Bph14、Bph15同时导入到汕优63的亲本明恢63和珍汕97B中，发现当组合双亲都含抗性基因时，比只有组合单亲一方含有抗性基因的抗性水平高，本研究结果与其相类似。

野生稻中含有丰富的优良基因，而广西普通野生稻遗传多样性无论在居群还是种内水平上都十分丰富[16]，在白叶枯、稻瘟病、细菌性条斑病、褐飞虱、白背飞虱等病虫害抗性方面拥有丰富的资源[17-20]，同时一些重要基因如Xa23、Bph14、Bph15等已在生产上发挥重要作用。选择好的抗源是抗性育种中首先要解决的问题，本研究的抗源是来自于广西普通野生稻的高抗渗入系HS204，本研究团队已经利用该抗源对多个恢复系进行了抗性改良[21]，表现良好，经多年连续鉴定和分析，确定该抗源含有遗传稳定的显性高抗褐飞虱基因。本研究用此抗源做供体，与保持系龙特甫B杂交和回交，采用分子标记辅助选育并结合苗期鉴定的方法快速筛选出抗性纯合的改良株系，在改良后代的低世代即开始选择农艺性较好的株系与不育系龙特甫A测配，选择对不育系具有保持能力的株系继续回交，再结合分子标记辅助选择及苗期鉴定，连续多代回交后获得抗性稳定的改良不育系。本研究获得的抗性保持系和改良中间材料，可为杂交稻抗性不育系的育种提供更好的基因源；获得的抗性不育系可直接应用于三系杂交稻的配组选育，对杂交稻抗褐飞虱育种具有重要应用价值。

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(责任编辑 温国泉)

Development of Three-line Maintainer and Sterile Lines with Resistance to

Brown Planthopper Using Marker Assisted Selection in Rice (OryzasativaL.)

GUO Hui, FENG Rui, CHEN Can, ZHANG Xiao-li, LIU Bai-long, QIN Xue-yi*

Using a high BPH resistance introgression line ‘HS204’ derived from Guangxi wild rice (OryzarufipogonGriff) as donor parent, high resistant maintainer line and sterile materials were bred by hybridization，backcross breeding and molecular marker-assisted selection, in order to provide good material basis for resistance breeding of hybrid rice. The results reflected that four maintainer intermediate materials(100B, 101B, 102B and 103B) and two resistant sterile lines(100A,103A) that homozygous resistant genes were obtained by marker selection, ten hybridized combinations that testcrossed with high resistant sterile line 100A displayed resistance well, 100A/R2586, 100A/KR838 and 100A/KR527 high resistance, and the rest for resistance to medium resistance. The yield per plant of 100A/KR527, 100A/R2586, 100A/MingHui63, 100A/FuHui838 and 100A/Gui99 were significantly higher than that of CK (TeYou7118), an increase range was 14.45 %-49.26 %. These resistant maintainer obtained would provide source gene better for hybrid rice, and sterile line would directlybe applied to three line hybrid rice.

Rice；BPH resistant varieties; Marker-assisted selection (MAS); Maintainer line; Sterile line

1001-4829(2016)12-2769-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.12.001

2016-09-01

国家自然科学基金地区基金项目(31560385)；广西自然科学基金项目(2012GXNSFDA053008，2014GXNSFB A118066，2015GXNSFAA139060)；广西科学研究与技术开发计划项目(桂科AB16380138)；广西农业科学院科技发展基金项目(2015JM06)

郭 辉(1982-)，男，山西临汾人，硕士，助理研究员，主要从事水稻抗逆资源评价与遗传育种研究，E-mail：gh8207@163.com,*为通讯作者，E-mail：qxueyi@gxaas.net。

S511

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