水飞蓟素联合ATP对化学药物性肝损伤作用效果研究

■王 敬邓 阳王梓卓吴国江*

（1.河北农业大学生命科学学院，河北保定071000；2.河北农业大学国土资源学院，河北保定071000）

肝脏是动物机体进行物质和能量代谢的主要场所，外源性化学药物进入机体后，需经肝生物转化降解以降低其毒副作用，减少对机体损伤，但若长期或大量服用化学性药物，势必造成药物在肝内沉积并对肝脏造成损伤，致使动物疾病频发，进而造成死亡，给养殖业造成巨大经济损失，同时残留的化学药物也会通过食物链直接或间接给人类健康带来的危害，从而引发诸多的食品安全问题。

三磷酸腺苷（ATP）是体内组织细胞一切生命活动所需能量的直接来源。肝功能受损，肝细胞内三羧酸循环出现受抑，导致肝内ATP水平下降[1]，进而造成蛋白质等合成受阻，影响机体正常的生命活动，所以对肝损伤机体及时补充ATP在一定程度上可以缓解机体细胞损伤进程，降低死亡率。但ATP只能临时补充体内缺乏的能量物质，对已损伤肝细胞无法进行修复，所以在补充ATP的同时，还需消除肝损伤因素，及时保护或修复受损肝细胞。大量试验证实[2]，水飞蓟素是护肝活性最高、最有效的物质，具有清除自由基[3]、抑制脂质过氧化[4]、稳定肝细胞膜[5]的作用，从而减轻肝细胞损伤[6]、促进肝细胞的修复和再生[7]。

本研究以小鼠为试验动物，将水飞蓟素与ATP按照单方使用剂量联用，通过考察ALT、AST、SOD、GSH、TP、ALB等指标，以及切片观察，探讨水飞蓟素与ATP联用对化学性药物肝细胞保护及受损细胞修复效果，为养殖业中经常发生的肝病防治提供适宜药物和理论依据。

1 材料

1.1 试验动物

健康成年清洁级SPF昆明小鼠[(18～22)g]70只，雌、雄各半。由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供（11401500008918）。

1.2 试验药品

水飞蓟素，购自盘锦德润生物科技有限公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒、总蛋白（TP）测定试剂盒、白蛋白(ALB)测定试剂盒，均购自中生北控生物科技股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；四氯化碳（CCl4）分析纯，购自天津市北方化玻购销中心；三磷酸腺苷购自国药集团荣生制药有限公司。

1.3 试验仪器

电子调温万用电炉（型号为DK-98-Ⅱ），购自上海亚荣生化仪器厂。旋转蒸发仪（型号为RE-52A），购自上海亚荣生化仪器厂。紫外-可见分光光度计（型号为752型），购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司。普通型离心机（型号为LDZ-52），购自北京离心机厂。数显恒温水浴锅（型号为HH-4），购自金坛市华特试验仪器有限公司。电子天平（型号为JA2103），购自金坛市华特试验仪器有限公司。电热恒温鼓风干燥箱（型号为DHG-9240A），购自上海飞越试验仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 小白鼠预饲

将70只小白鼠在常温下，自由饮食7 d，待动物适应后，依试验分为空白组(Ⅰ组)和受试组(6组)，其中空白组(10只)饲喂蒸馏水(0.2 ml/只)，其余各组(10只/组，共60只)分别均灌胃30%CCl4溶液(0.2 ml/只)，给药3 d后依据以血清转氨酶（AST和ALT）、肝组织指标(SOD和GSH)和病理切片进行分析评价，确定造模成功。

2.2 试验动物的分组及给药剂量

试验造模成功后，将各受试组随机分为模型对照组（Ⅱ组）、ATP组（Ⅲ组）、水飞蓟素组（Ⅳ组）、水飞蓟素联合ATP低剂量组（Ⅴ组）、水飞蓟素联合ATP中剂量组（Ⅵ组）、水飞蓟素联合ATP高剂量组（Ⅶ组）及空白对照组（Ⅰ组），共7组，每组10只小鼠，其中空白对照组（15 ml/kg），ATP组（15 ml/kg，其中ATP 0.6 mg/ml）；水飞蓟素组（15 ml/kg，其中水飞蓟素2.06 mg/ml）；水飞蓟素联合ATP低剂量组（15 ml/kg，其中水飞蓟素2.06 mg/ml，ATP 0.6 mg/ml）；Ⅵ组水飞蓟素联合 ATP中剂量组（15 ml/kg，其中水飞蓟素4.12 mg/ml，ATP 1.2 mg/ml）；Ⅶ组水飞蓟素联合ATP高剂量组（15 ml/kg，其中水飞蓟素8.24 mg/ml，ATP 2.4 mg/ml），共给药7 d。试验结束后，采用摘除眼球方法取血进行试验研究。

3 水飞蓟素联合ATP的使用对CCl4所致肝损伤的作用效果研究

3.1 采血

3.1.1 血清的制备

给药结束后于第8 d采用摘除眼球取血方法，将采到的血于3 500 r/min离心l0 min分离血清，4℃保存待测。

3.1.2 肝匀浆的制备

剪取0.6 g肝组织，加入5.4 ml的生理盐水充分研磨，立即制成10%的肝匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液备用。

3.2 水飞蓟素联合ATP对小鼠肝细胞修复程度的测定

血清中所检测的ALT和AST活性的高低反映了细胞的损伤程度，而蛋白质产生的多少则反映出肝脏的功能是否恢复，因此，试验通过检测小鼠血清中ALT和AST活性的多少来反映药物对小鼠肝细胞损伤的修复程度，对ALB和TP的含量的检测来反映肝脏功能恢复的程度。操作方法按照ALT、AST、ALB和GTP试剂盒的操作步骤进行。

3.3 水飞蓟素联合ATP对小鼠肝细胞损伤保护程度的测定

SOD和GSH为肝脏中的还原性物质，能够与肝脏中的自由基反应从而保护肝脏细胞免于自由基的损伤。因此，试验用检测肝脏中SOD和GSH的活性来观察药物对小鼠肝脏的保护作用。操作方法按照SOD和GSH试剂盒的操作步骤进行。

3.4 水飞蓟素联合ATP对小鼠肝脏结构的影响

用HE染色石蜡切片，采用光学显微镜对封固好的切片进行观察，并连接电脑进行拍照。

3.5 试验数据分析

所得数据用SPSS21.0软件进行方差分析，数据以“平均值±标准差表示。

4 结果

4.1 水飞蓟素联合ATP对小鼠肝细胞修复程度的作用效果（见表1、表2）

表1 小鼠血清中AST、ALT的活性测定结果(x±s)

表2 小鼠血清中ALB、TP含量测定结果（x±s）

由表1可见，与Ⅰ组相比，Ⅱ组的AST和ALT的活性极显著升高（P＜0.01），说明试验造模成功；与Ⅱ组相比，各试验组AST和ALT活性极显著降低（P＜0.01），说明各药物均对AST和ALT活性的升高有较好的抑制作用；但Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组与Ⅰ组相比AST和ALT活性的差异极显著（P＜0.01），Ⅵ组、Ⅶ组的AST和ALT与Ⅰ组相比差异不显著（P＞0.05），说明Ⅵ组、Ⅶ组的药物能够使小鼠的AST和ALT活性降低且接近恢复正常状态。

由表2可见，与Ⅰ组相比，Ⅱ组ALB的含量极显著降低（P＜0.01），TP的含量极显著升高（P＜0.01），表明CCl4模型试验成功；与Ⅱ组相比，各试验组ALB的含量极显著升高（P＜0.01），TP含量极显著降低（P＜0.01），说明各药物均可以使ALB的含量升高，使TP降低。但Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组与Ⅰ组的ALB和TP含量相比差异极显著（P＜0.01），Ⅵ组、Ⅶ组与Ⅰ组的ALB和TP含量相比差异不显著（P＞0.05），说明Ⅵ组、Ⅶ组的药物能够使小鼠的ALB含量升高、TP含量降低且接近恢复正常状态。

4.2 水飞蓟素联合ATP对小鼠肝细胞损伤保护程度的作用效果（见表3）

由表3可见，与Ⅰ组相比，Ⅱ组的SOD和GSH的活性极显著降低（P＜0.01），说明试验造模成功；各试验组与Ⅱ组比较SOD活性和GSH的活性极显著升高（P＜0.01），说明各药物组均可以使SOD和GSH的活性升高；但Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组与Ⅰ组的SOD和GSH活性相比差异极显著（P＜0.01），Ⅵ组、Ⅶ组与Ⅰ组的SOD和GSH活性相比差异不显著（P＞0.05）说明Ⅵ组、Ⅶ组的药物能够使小鼠的SOD和GSH活性升高且接近恢复正常状态。

表3 小鼠血清中SOD、GSH活性测定结果（x±s）

4.3 水飞蓟素联合ATP对小鼠肝脏结构的影响（见图1）

图1 小鼠肝脏病理切片

由图1可见，正常组小鼠肝索排列正常，放大倍数可观察到无炎性细胞浸润和坏死，模型对照组小鼠，肝索纹理不清晰，高倍镜下可看到炎性细胞浸润、肝细胞坏死严重，说明试验造模成功。当给小鼠灌胃水飞蓟素联用ATP的中、高剂量时可观察到肝索排列基本正常，高倍镜下细胞的炎性浸润减轻，细胞死亡数明显减少，与空白组接近。

5 讨论

化学药物性肝损伤在养殖业中属于常见的多发病。发病初期的动物主要表现为消化不良、食欲不振。若不及时治疗则会使动物出现肝炎、肝硬化甚至是死亡[8]，给养殖业带来巨大的经济损失。目前，对于化学药物性肝损伤的治疗大多数为西药制品，然而西药往往在治疗肝病的同时会产生极大的副作用[9]，损伤其他器官，因此，不能从根本上解决化学药物性肝损伤的问题。试验摒弃了西药的弊端，使用传统的保肝类中药水飞蓟素[10]，并在其基础上添加ATP，保证了在治疗化学药物性肝损伤时及时为受损的肝细胞进行能量补充，缓解机体细胞损伤[11]。二者联用，相辅相成，最终达到解决化学药物性肝损伤的目的。

化学性药物对肝损伤因子，主要侧重于自由基。化学药物在酶CYP2E1的作用下产生的自由基即可与蛋白质中的巯基共价结合，导致蛋白质功能发生障碍[12]，也可与氧结合生成过氧化物使脂质发生过氧化反应[13]，同时自由基还可破坏细胞膜并直接攻击线粒体和DNA，影响能量和DNA的合成[14]，导致细胞凋亡和坏死进而引发整个肝脏功能障碍，使动物出现消化不良、食欲不振等症状[15]。Recknagel等[16]通过试验证实，机体中的还原性物质SOD（超氧化物歧化酶）和GSH（还原型谷胱甘肽）能与自由基结合成结合物，从而降低对肝脏的损伤。因此，在饲料中添加能够促进机体内还原物质释放或使受损的细胞恢复产生还原性物质功能的保肝药物可在一定程度上降低对动物肝脏的损害。

SOD和GSH能够与自由基反应[17]，从而降低自由基对肝细胞的损伤作用，当二者含量降低时会导致过量的自由基不能够被清除而引发脂质过氧化和细胞的坏死。试验结果显示，小鼠在灌胃水飞蓟素联合ATP中、高剂量后SOD和GSH的活性升高，且与四氯化碳组比较差异极显著（P＜0.01），与空白组比较差异不显著（P＞0.05），说明药物在提高SOD和GSH活性的方面有很好的的作用[18]，能够在一定程度上缓解由自由基引起的脂质过氧化和细胞的坏死；化学药物性肝损伤除了引发自由基，造成肝细胞损伤外，还可造成血清中AST和ALT[19]活性的变化。AST和ALT[19]存在于细胞的胞浆中，当细胞膜受损时，位于胞浆中的AST和ALT外流，导致血清中的AST和ALT的活性升高。因此，检测血清中AST和ALT活性，可直接反映细胞膜的损伤程度。试验证实，中、高剂量水飞蓟素与ATP联用后小鼠血清中AST和ALT的活性降低且与四氯化碳组相比差异极显著（P＜0.01），与空白组相比较差异不显著（P＞0.05），说明药物在一定程度上能够降低细胞膜的损伤，从而抑制胞浆中AST和ALT的外流，使血清中AST和ALT活性降低。

白蛋白(ALB)、总蛋白（TP）只有在肝脏中才能够合成，其水平的高低是检测肝损伤的标志性指标之一[20]，若ALB的含量降低，TP的含量升高则会导致急慢肝炎的发生。试验结果显示，小鼠在灌胃水飞蓟素联合ATP中、高剂量药物后ALB的含量升高，TP的含量降低，且与四氯化碳组相比差异极显著（P＜0.01），与空白组比较差异不显著（P＞0.05），说明药物在提高ALB和降低TP的含量的方面有很好的作用，能够在一定程度上缓解急慢性肝炎的发生。从试验切片也能看出，四氯化碳模型对照组，小鼠肝索纹理不清晰，有炎性细胞浸润、肝细胞组织坏死灶，而灌胃水飞蓟素联合ATP中、高剂量组的小鼠，肝索排列基本正常，细胞炎性浸润减轻，死亡细胞数明显减少，与空白组接近，说明水飞蓟素联合ATP中、高剂量组的药物对小鼠肝损伤有一定的缓解作用。

试验证实，联合应用水飞蓟素和ATP中、高剂量，可以较好缓解化学药物性肝损伤的问题，使肝脏恢复生产SOD和GSH的能力，降低自由基对肝脏细胞的损伤，使肝脏恢复正常功能，抑制化学药物性肝损伤的进一步发展，为养殖业解决化学性药物肝损伤提供理论和试验依据。