固态发酵麸皮制备复合多糖的菌种和营养盐优化

2017-01-08安晓萍史俊祥王瑞芳王乃凤齐景伟

饲料工业 2017年22期

■安晓萍王园史俊祥王瑞芳王乃凤齐景伟

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特010018）

小麦麸皮是小麦加工面粉的副产物，约占小麦籽粒重的22%～25%[1]。麸皮含有10%～15%淀粉、12%～18%蛋白质、4%～6%灰分以及一些次要的组分[2]。除此之外，麸皮还含有46%的非淀粉多糖（Non-starch polysaccharides，NSP）[3]，但非淀粉多糖的存在会导致畜禽对饲料中的营养物质利用率降低，原因是畜禽内源性消化酶不能分解或是不能彻底分解其中的化学键，被细胞壁中各种化学键束缚的营养物质难以释放出来，使消化酶难以充分接触胞内营养物质，导致饲料的利用消化率低，故长期以来非淀粉多糖被视为抗营养因子。随着研究的逐渐深入，人们发现麦麸非淀粉多糖中的非纤维多糖具有诸多可贵的生物活性，如抗氧化、免疫调节和益生作用等，因此，此类多糖又称为麸皮活性多糖，简称麸皮多糖。

微生物发酵法制备多糖是近些年发展起来的一种生物方法，该方法是利用完整的微生物细胞作为生物催化剂，与酶转化法相比而言，省去了酶的筛选、提取和纯化等两到三个步骤，节约了经济成本。同时，该方法制备出的多糖既包括菌体多糖、基质多糖，又包括发酵工程中转化的多糖，故称为复合多糖[4]。微生物发酵法制备多糖常用菌种主要有食用菌、霉菌等，鲜有利用细菌和酵母菌发酵制备复合多糖。本研究利用酵母菌、枯草芽孢杆菌等菌株固态发酵麸皮制备复合多糖饲料添加剂，筛选出合适的发酵菌株和营养盐组成，为发酵麸皮多糖的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

酿酒酵母CGMCC 2.119(Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.119)、枯草芽孢杆菌CGMCC 1.0892(Bacillus subtilisCGMCC 1.0892)购买于中国微生物菌种保藏中心；植物乳杆菌P8（Lactobacillus plantarumP8）由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供；地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）由内蒙古农业大学生物饲料工程实验室提供。

1.1.2 原料

麸皮、豆粕粉、玉米粉均购于市场。

1.1.3 培养基

枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的种子液培养基均为营养肉汤培养基；酿酒酵母菌种子液培养基为麦芽汁液体培养基；植物乳杆菌种子液培养基为MRS培养基。

基础固态培养基：麸皮80%、豆粕粉10%、玉米粉10%、料水比1∶1。

1.2 主要试验仪器

手提式压力蒸汽灭菌器[上海申安医疗器械厂（中国）]、SW-CJ超净工作台[上海新苗医疗器械（中国）]、GX2型智力光照培养箱[宁波东南仪器有限公司（中国）]、SH2-82旋转气浴恒温振荡器[金坛市岸头中旺实验仪器厂（中国）]、酶标仪[BioO-Rad公司（美国）]、TG16-WS台式高速离心机[湖南湘仪仪器开发有限公司（中国）]、电热恒温水浴锅[上海医疗器械有限公司（中国）]。

1.3 试验方法

1.3.1 种子液的制备

酿酒酵母菌种子液的制备：将保藏的酿酒酵母接种于灭菌（121℃、0.1 MPa）的麦芽汁培养基中，培养24 h（37 ℃、120 r/min），使菌体浓度达到108cfu/ml。

枯草芽孢杆菌种子液的制备：将保藏的枯草芽孢杆菌接种于灭菌（121℃、0.1 MPa）的营养肉汤培养基中，培养24 h（37 ℃、120 r/min），使菌体浓度达到108cfu/ml。

植物乳杆菌种子液的制备：将保藏的植物乳杆菌接种于灭菌（121℃、0.1 MPa）的MRS培养基中，静置于35℃的培养箱内培养24 h，此时菌体浓度达到108cfu/ml。

地衣芽孢杆菌种子液的制备：将保藏的地衣芽孢杆菌接种于灭菌（121℃、0.1 MPa）的营养肉汤培养基中，培养24 h（37 ℃、120 r/min），此时菌体浓度达到108cfu/ml。

1.3.2 试验设计

1.3.2.1 菌种优化

① 菌种筛选。将酿酒酵母（Sc）、枯草芽孢杆菌（Bs）、植物乳杆菌（Lp）和地衣芽孢杆菌（Bl）4种菌以单菌、双菌、三菌和四菌组成方式搅拌均匀，分别接种至灭菌后的基础发酵底物中，接种量10%，置于35℃恒温培养箱中静置发酵48 h，测定发酵产物中复合多糖含量。

②菌种比例。将上述最佳组合菌按不同比例接种至灭菌后的基础发酵底物中，接种量10%，搅拌均匀，置于35℃恒温培养箱中静置发酵48 h，测定发酵产物中复合多糖含量。

1.3.2.2 营养盐优化

① Plackett-Burman（PB）试验。发酵总体系为100%，总接种量10%，酿酒酵母∶枯草芽孢杆菌=7∶3接种于基础固态培养基，搅拌均匀，置于35℃恒温培养箱中静置发酵48 h。选用试验次数为20次（N=20）的Plackett-Burman试验设计，对MgSO4、虚拟项1、Mn-SO4、CaCl2、虚拟项2、K2HPO4、尿素、柠檬酸钠、酒石酸钾钠、腐植酸钠10个因素进行筛选，每个因素取低水平“-1”和高水平“1”，响应值为发酵产物中的复合多糖产量。Plackett-Burman试验设计因素水平见表1。

表1 Plackett-Burman design试验因素水平

②单因素试验。根据Plackett-Burman试验结果，对差异显著的因子进一步通过单因素试验，以发酵底物中复合多糖含量为指标，确定最适添加量。

1.3.3 多糖的提取

将发酵产物和未发酵原料于45℃烘箱中烘干（24 h）后粉碎，10 g干燥发酵麸皮加入200 ml水中，80 ℃水浴30 min，离心(常温，5 000 r/min、10 min)取上清，上清液加入4倍体积的95%乙醇，静置过夜，离心收集沉淀物，沉淀用蒸馏水复溶后即得多糖溶液。

1.3.4 多糖的测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖得率[5]。

1.3.5 数据分析

采用Minitab17软件进行Plackett-Burman试验设计及结果分析；SAS 8.1统计软件ANOVA模型对确定尿素添加量的试验数据进行单因素方差分析，多重比较采用Duncan's检验，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 菌种优化结果

不同菌株对发酵麸皮中多糖含量的影响结果见图1。由图1a可以看出，经过单菌种发酵，发酵麸皮中多糖含量由高到低依次为地衣芽孢杆菌＞酿酒酵母菌＞枯草芽孢杆菌＞植物乳杆菌。其中，地衣芽孢杆菌发酵麸皮后多糖含量显著高于其他菌种(P＜0.05)。由图1b可以看出，经过混菌发酵，发酵麸皮多糖产量由高到低依次为枯草芽孢杆菌+酿酒酵母菌＞地衣芽孢杆菌+酿酒酵母菌＞枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌+酿酒酵母菌＞植物乳杆菌+枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌+酿酒酵母菌＞其他菌种组合。其中，枯草芽孢杆菌+酿酒酵母菌双菌组合的发酵麸皮中多糖含量显著高于其他菌种组合(P＜0.05)，且高于单菌地衣芽孢杆菌发酵麸皮中多糖含量。因此，本试验选择枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌双菌混合发酵麸皮制备复合多糖饲料添加。

图1 不同菌种发酵对多糖含量的影响

枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌不同比例发酵麸皮中多糖含量的变化见图1c，由图1c可见，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌以3∶7比例发酵麸皮中多糖含量最高，可达53.67 mg/g，因此，本试验选择枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌以3∶7比例混合固态发酵麸皮制备复合多糖饲料添加。

2.2 Plackett-Burman优化营养盐结果

2.2.1 Plackett-Burman试验设计与结果(见表2～表3)

由表3的Plackett-Burman的试验方差分析结果可知，8种因素对于麸皮多糖产量影响的重要性顺序为：尿素＞MnSO4＞K2HPO4＞MgSO4＞酒石酸钾钠＞腐植酸钠＞CaCl2＞柠檬酸钠，其中尿素显著影响发酵产物中的多糖含量（P＜0.05），且具有正效应（T＞0），其他因素对发酵产物中的多糖含量无显著影响（P＞0.05）。由此，进一步通过单因素试验确定尿素最适添加量。

表2 Plackett-Burman试验设计与结果

表3 Plackett-Burman试验方差分析结果

2.2.2 尿素最适添加量的确定(见表4)

由表4可以看出，在试验因素水平选取范围内，随着尿素添加量的增加，发酵产物中麸皮多糖产量呈现先增加后减少的趋势，当尿素添加量为0.10%时麸皮多糖产量达到最大值，显著高于其他添加量（P＜0.05）。因此，将尿素最适添加量确定为0.10%。

表4 尿素对麸皮多糖产量的影响

3 讨论

近几年，发酵方式逐渐由单菌发酵发展为混菌发酵，其原因在于多菌种之间存在协同作用，可降低单菌发酵的劣势[6]。吴学凤等(2012)[7]和陈洪伟等(2011)[8]分别以不同指标发酵麸皮，都发现混菌发酵效果优于单一菌种发酵。但是这种菌种之间的配伍不是盲目性的，在选择和应用上要注重不同微生物之间的协同性和互补性，因为不同微生物之间也许存在颉颃作用。就本试验而言，单菌发酵产糖量最多的是地衣芽孢杆菌，但该菌与其他菌种共同发酵时，产糖量却没有其单菌发酵量高，可能是该菌种在多菌共生的环境里，自身生长或是酶的活性受到了抑制；植物乳杆菌自身的酶系统较其他菌种来说不发达，故其单菌发酵麸皮生产多糖的能力也较弱，再加上其在发酵过程中产酸不断降低发酵底物pH值，会影响其他菌种的生长代谢[9]，因此，有植物乳杆菌参与的多菌种发酵，其产多糖的能力也普遍低于其他混菌组合。枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的单菌发酵麸皮生产多糖能力不是最强的，但是二者共同发酵的多糖含量却是最高，二者之间可能存在共生作用，代谢产物发生互补效应，增加了麸皮多糖的含量。

通过Plackett-Burman试验设计，将可能影响发酵产物中多糖产量的8种增效剂（MgSO4、MnSO4、Ca-Cl2、K2HPO4、尿素、柠檬酸钠、酒石酸钾钠和腐植酸钠）进行了两水平的筛选优化。结果发现：该8种增效剂中只有尿素对发酵底物中麸皮多糖产量具有显著影响(P＜0.05)。尿素作为一种速效氮源，能够被微生物直接吸收利用[10-11]，有利于微生物的生长代谢，提高了发酵菌种所分泌酶的产量，使得更多的酶与发酵底物作用，进而提高多糖产量；同时，由向云等(1990)[12]、杨游（2004）[13]和闫贵龙（2005）[14]等学者的研究结果推断，可能是尿素对发酵原料产生了氨化作用，麸皮经氨化处理后孔隙率增多，以致其吸附酶的表面积增大，从而有助于酶作用的进行。试验同样发现发酵底物中添加无机盐或有机盐对麸皮多糖产量无显著影响，这可能是发酵底物中含有的无机、有机盐足以满足发酵微生物的生长代谢，不需要额外添加。腐植酸钠作为多功能高分子复合物，含有多种活性基团，可以为微生物生长代谢提供营养物质，同时也可以通过其自身强大吸附作用，吸附其代谢产生的代谢废物，实现促进了其生长的作用。刘娜等（2013）[15]研究发现腐植酸钠会提高枯草芽孢杆菌活菌数量及发酵产物中多肽的产量，作者通过研究发现，腐植酸钠会对酵母菌的活菌数和发酵产物中可溶性糖、可溶性蛋白和真蛋白质等产生影响[16]。但在本试验中腐植酸钠的添加未促进多糖产量，可能是由于高水平添加的腐植酸钠会形成胶体，增加发酵底物黏度，降低空气进入发酵底物的机会，出现抑制菌体生长现象[17]。