食品安全国家标准GB 1886.174—2016中普鲁兰酶（比色法）检测方法的解读

■程 瑛 徐 丽 陈雪姣 邓晓旭 张雅洁 洪泽坤 周 樱 熊海容

（1.武汉新华扬生物股份有限公司，湖北武汉430074；2.中南民族大学，湖北武汉430074）

由于普鲁兰酶来源不同，它的酶学性质存在着很大的差异，而关于酶活性的检测方法，各厂家企业都是根据酶的性质制定的，在国家标准没统一之前，酶活性检测方法并不能统一。程池等在1988年提出了改善Kobayashi的碘色法，主要有以糯米淀粉为底物的碘色法和以普鲁兰多糖为底物的3,5-二硝基水杨酸（DNS）法两种酶活性测定法[4]。而DNS比色法简便快捷，使用更加广泛，但由于DNS的配制方法版本较多，导致酶活性的结果差异很大。国家标准GB 1886.174—2016规定了两种酶活性测定方法，比色法和染色普鲁兰（红）法，从根本上统一了普鲁兰酶活性测定的方法。

阿卡波糖在国标GB 1886.174—2016中重复出现，意义很大，但是关于阿卡波糖在酶制剂方面的应用鲜有报道，在医用领域报道的比较多。阿卡波糖是一种很复杂的低聚糖，它可逆地抑制小肠黏膜刷状缘上的α-糖苷酶活性，其抑制力的顺序为葡萄糖淀粉酶＞蔗糖酶＞麦芽糖酶＞异麦芽糖酶[5]。阿卡波糖（Acarbose）是临床常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂，属于2型糖尿病的常用药物之一，它是一种生物合成的假性四糖，能抑制小肠壁细胞的α-糖苷酶活性，从而延缓肠道内寡糖、双塘或多糖的降解，延缓葡萄糖和果糖的吸收和降解，以达到降低餐后血糖的效果[6]。国标提到添加阿卡波糖的作用是抑制样品中葡萄糖淀粉酶的活性。如果酶制剂产品里面含有其他可水解普鲁兰多糖（如葡糖淀粉酶），就需要加入一定量的阿卡波糖。

本文根据实验室具体情况选择常见的比色法作为研究对象，通过系列试验来解析国标中各参数对酶活性的影响，以便于更好地理解国标。

1 材料与方法

除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合GB/T 6682中规定的二级水。

1.1 试剂材料

普鲁兰酶、糖化酶、中温淀粉酶均来源于武汉新华扬生物股份有限公司。

普鲁兰多糖P4516(Sigma公司)、普鲁兰多糖P0978(TCI公司)、3,5-二硝基水杨酸(国药集团化学试剂有限公司)、阿卡波糖(购于市场)、无水乙酸钠(国药集团化学试剂有限公司)、冰乙酸(国药集团化学试剂有限公司)、无水葡萄糖(国药集团化学试剂有限公司)、HH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)、WH-2微型旋涡混合仪(上海泸西分析仪器有限公司)、移液器(Thermo公司)、THZ-82恒温振荡器(国华电器有限公司)。

由于饲料添加剂木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶和纤维素酶活性测定方法中使用的终止剂DNS配制方法均同于GB/T 23874—2009中的DNS试剂，因此，本文选取了GB/T 23874—2009中的DNS试剂作为对比。

1.2 方法

1.2.1 普鲁兰酶活性测定

各个单位要支持、鼓励会计人员的到访调查以及研究，并且各个单位要自觉接受会计监督，与其他单位交流意见。这样做既能够处理好核算、监管与管理这三者的关系，并且也可以加深核算、监管与管理这三者的交流，充分发挥会计职能的作用。同时还要构建有效的约束机制，定期深入到单位来分析经济活动等，不断规范管理。

采用3，5-二硝基水杨酸法，在1.0 ml的0.5%的普鲁兰多糖溶液（用醋酸缓冲液配制）中加入1.0 ml适当稀释的酶液，于60℃保温反应30 min，加入3,5-二硝基水杨酸DNS试剂3.0 ml，沸水浴7 min后取出，迅速冷却至室温，加入10 ml水，摇匀，以空白管中溶液（对照液先加终止剂DNS，保温30 min后加入1.0 ml适当稀释的酶液）调仪器零点，用分光光度计在波长550 nm下测量溶液的吸光度。酶活单位定义为在上述条件下，1 ml或1 g产品每分钟催化分解普鲁兰多糖生成1 μmol葡萄糖的还原糖所需的酶量为1个酶活性单位。

1.2.2 影响普鲁兰酶活性因素的部分试验

1.2.2.1 阿卡波糖及淀粉酶制剂的添加对普鲁兰酶活性的影响的试验

设计几组试验，其中包括a组：普鲁兰酶；b组：普鲁兰酶+糖化酶；c组：普鲁兰酶+中温淀粉酶；d组：普鲁兰酶+糖化酶+中温淀粉酶。按一定比例配置四组试验用酶制剂，添加阿卡波糖，采用比色法分别检测四组酶制剂中的普鲁兰酶的酶活性；同时进行四组不添加阿卡波糖试验组，并进行比较。试验设计如表1。

表1 试验设计

1.2.2.2 两种底物Sigma P4516和TCI P0978对普鲁兰酶活性的影响的试验

设计如表1的四组酶制剂，分别使用不同厂家的底物进行酶活性检测，最后进行比较。

1.2.2.3 不同配制方法的3,5-二硝基水杨酸试剂对普鲁兰酶活性影响的试验

设计如表1的四组酶制剂，分别使用不同方法配置的3,5-二硝基水杨酸试剂作为终止剂，进行普鲁兰酶活性的检测，最后进行比较。

2 结果

2.1 阿卡波糖及淀粉酶制剂的添加对普鲁兰酶活性的影响

阿卡波糖及淀粉酶制剂对普鲁兰酶活性测定的影响结果见表2。比较a组，相对标准偏差3.61%，可以判断阿卡波糖对单一普鲁兰酶活性的测定没有明显影响；比较b、d组，相对标准偏差38.23%、18.15%可知，糖化酶的添加对普鲁兰酶活性的影响非常大，但阿卡波糖可消除这种影响，它可抑制样品中糖化酶的活力，这也是国标中为什么要求添加阿卡波糖的原因；比较c、d组相对标准偏差14.20%、18.15%可知，中温淀粉酶对普鲁兰酶活性的测定也有一定的影响。

表2 阿卡波糖及淀粉酶对普鲁兰酶活性影响

2.2 两种底物Sigma P4516和TCI P0978对普鲁兰酶活性的影响

不同厂家的底物对普鲁兰酶活性的影响结果见表3。比较a、b、c、d四组的两个厂家的底物的试验结果，相对标准偏差分别为3.26%、0.90%、8.82%和6.83%，可以看出，TCI厂家的底物测试的酶活性结果高于Sigma公司的结果，并且相对标准偏差均在10%以内，如果按照国家标准中在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%，加上实验员的偶然误差，两种底物的检测结果差异并不是很大，因此，这两家公司的底物在某种程度上，具有相同的作用效果。

表3 不同厂家的底物对普鲁兰酶活性的影响

2.3 不同配制方法的3,5-二硝基水杨酸试剂对普鲁兰酶活性的影响

不同配制方法的3,5-二硝基水杨酸试剂对普鲁兰酶活性的影响结果见表4。比较两种不同配制方法的DNS的四组试验，他们之间的转换系数分别是1.502 6、1.489 5、1.502 1、1.502 5，从转换系数上看，无论是否添加淀粉酶，GB/T 23874—2009中的DNS测试的酶活性结果均比新国家标准测试的酶活性结果高，并且它们之间的转换系数大约是1.5倍的关系。如果实验室使用的GB/T 23874—2009的DNS比较多，可以考虑使用GB/T 23874—2009的DNS，测试酶活性结果除以1.5即可。

表4 不同配制方法DNS对普鲁兰酶活性影响

3 讨论

3.1 阿卡波糖及淀粉酶制剂的添加对普鲁兰酶活性的影响。

从试验结果来看，阿卡波糖的添加对试验结果影响很大。通过几组重复试验的结果分析，如果酶制剂中只含有一个酶种普鲁兰酶，则是否添加阿卡波糖，对其试验结果基本没有影响。而试验组中的b、c组和d组试验结果显示添加阿卡波糖与否对试验结果影响很大，因此，比较符合国家标准中添加阿卡波糖的要求。淀粉酶有很多种，本试验中选择的中温淀粉酶是α-淀粉酶的一种，属于内切酶，作用机理是从淀粉分子内部随机切割α-1，4-糖苷键，不切α-1，6-糖苷键；而糖化酶是外切酶，从非还原末端依次切割葡萄糖单位，遇到α-1，4键或α-1，6键都能水解。而普鲁兰酶是脱支酶的一种，属于内切酶，水解支链淀粉和糖原中的α-1，6-糖苷键。从作用方式和专一性来看，糖化酶的添加对普鲁兰酶活性影响很大，而中温淀粉酶的影响相对较小。

3.2 两种底物P4516和P0978对普鲁兰酶活性的影响。

国家标准中使用的底物是Sigma公司的P4516普鲁兰多糖，本试验选取了TCI公司的P0978的底物，同Sigma公司的底物进行比较，通过多组重复试验发现TCI公司的底物检测出的酶活性高于Sigma公司，通过多组重复试验，也可以得出一定的转换系数。根据实验室的实验条件，特殊情况下可以考虑使用不同厂家的底物，以到达相同的效果。

3.3 不同配制方法的3,5-二硝基水杨酸试剂对普鲁兰酶活性的影响。

由于DNS试剂配制较繁琐，使用周期较长，很多企业院校使用的DNS并非国家标准GB 1886.174—2016中的DNS，本实验室使用GB/T 23874—2009的DNS试剂较多。对比这两种DNS试剂的配制方法，成分相同，只是浓度存在一定差异，造成对葡萄糖的显色能力不同。GB/T 23874—2009的DNS试剂检测的酶活性结果高于国家标准GB 1886.174—2016中DNS的检测结果，在试验没有特殊的要求下，可以考虑采用GB/T 23874—2009的DNS试剂作为终止剂，检测结果除以转化系数即可。但是，在一般情况下，应按照国家标准来检测普鲁兰酶的酶活性。

4 结论

①阿卡波糖及淀粉酶对普鲁兰酶活性的测试影响很大，阿卡波糖的作用机制目前尚未清楚，还需试验进行研究。

②可以寻找具有相同作用效果的普鲁兰多糖作为试验用底物，如果实验室使用的普鲁兰国标GB 1886.174—2016DNS试剂比较少，可以考虑使用GB/T 23874—2009的DNS试剂或者实验室常用的DNS试剂来替代国家标准中的DNS试剂，以减少试验检测成本。但是，在没有特殊情况下，必须严格按照国家标准执行。

③本研究中所列出的所有参数均对普鲁兰酶活性检测有影响，这仅代表本实验室的研究结果，仅供参考，为普鲁兰酶活性检测可能会产生的误差提供一些帮助。