健脾补肾法对骨髓抑制小鼠造血功能的影响※

宋兴华 赖毛华 刘 华 叶振宇 夏鑫华

（广州医科大学附属第一医院中医科，广州510120）

健脾补肾法对骨髓抑制小鼠造血功能的影响※

宋兴华 赖毛华 刘 华 叶振宇 夏鑫华

（广州医科大学附属第一医院中医科，广州510120）

目的探讨健脾补肾法对骨髓抑制小鼠造血功能的影响。方法取BALB/c小鼠60只，按照体重将60只雄性小鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、健脾补肾法组，每组15只。模型组、阳性对照组、健脾补肾法组小鼠按照0.1 mL/10 g体重腹腔注射8 mg/mL环磷酰胺溶液（剂量为80 mg/kg），正常对照组小鼠按照0.1 mL/10 g体重腹腔注射0.9%氯化钠注射液，每天1次，连续3天。确定小鼠造模成功后，健脾补肾法组小鼠每日上下午分别按照0.2 mL/10 g体重灌胃给予2 g/mL健脾补肾方及龟鹿二仙丹，阳性对照组小鼠每日按照0.1 mL/10g体重腹腔注射12.5 μg/mL rhG-CSF，每天1次，连续给药7天。正常对照组和模型组均按照0.2 mL/10 g体重灌胃给予纯净水。末次给药后24 h，经小鼠眼球后静脉丛采血，用装有EDTA-Na抗凝剂的采血管收集，用全自动血细胞分析仪进行白细胞检测。颈椎脱臼处死各组小鼠，检测骨髓造血细胞集落形成和骨髓有核细胞的情况。结果健脾补肾法具有促使骨髓抑制小鼠骨髓细胞解除Go/G1期阻滞、促使Go/G1期细胞向S期细胞以及加速S期细胞向G2/M期细胞转化，从而促进骨髓细胞增殖的作用。结论健脾补肾法对化疗后所致骨髓抑制有显著的改善和恢复作用。

健脾补肾法；骨髓抑制；实验研究；虚劳

目前化学治疗仍是恶性肿瘤治疗的主要手段之一，临床上大多数化疗药物可导致有不同程度的骨髓抑制，这既降低患者的生存质量，又影响了抗癌治疗，有的患者不得不因此而中途停药，有的甚至危及生命。因此，如何预防和减轻化疗导致的骨髓抑制，促进骨髓造血功能恢复，升高外周血白细胞和血小板，已成为保证化疗顺利完成，提高临床疗效的关键问题。中医学多将化疗后骨髓抑制归于脾肾两虚、气血不足，临床多以益气补血为主要的治疗方法，但疗效还不尽理想。笔者在多年临床实践中体会到健脾补肾法效果会更好，但其作用机制不明，相关的实验研究报道较少。本实验观察了健脾补肾法对环磷酰胺诱发骨髓抑制的影响，并对其作用机理作了初步探讨。

1 材料及仪器

1.1 动物BALB/c小鼠，SPF级；60只，雄性；体重：18.1～22.0 g；实验动物质量合格证明号：44007200015247。实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2013-0002。

1.2主要试剂与仪器主要仪器：JEA3001系列电子天平：精度0.1 g，上海浦春计量仪器有限公司；7020型全自动生化仪，HITACHI公司产品；BD AccuriC6流式细胞，美国BD公司产品。

主要试剂：细胞周期试剂盒，批号20131050，有效期至20161004，上海七海复泰生物科技有限公司产品；氢氧化钾，批号130227，有效期至20180226，广州市中南化工仪器有限公司产品；甲醇，批号141006，有效期至20171005，广州市中南化工仪器有限公司产品。

1.3 中药治疗

1.3.1 健脾补肾方黄芪50 g，女贞子15 g，党参15 g，淮山药15 g，茯苓15 g，白术15 g，桑椹15 g，菟丝子15 g，黄精30 g，鸡血藤60 g，淫羊藿15 g，肉苁蓉15 g，山萸肉15 g。将上述药材混匀，浸泡1小时，煎煮2次，加水量分别为药材量的10倍、6倍；煎煮时间分别为1.5 h、1 h，合并二次水煎液，过滤，滤液，浓缩成含生药2 g/mL的药液。

1.3.2 龟鹿二仙丹加味生龟甲50 g（先煎），鹿角霜15 g（烊化），阿胶15 g（烊化），枸杞子15 g，西洋参15 g，沙参30 g。将上述药材混匀，浸泡1小时，煎煮2次，加水量分别为药材量的10倍、6倍；煎煮时间分别为1.5 h、1 h，合并二次水煎液，过滤，滤液，浓缩成含生药2 g/mL的药液。

1.4 研究方法

1.4.1 模型制作模型组、阳性对照组、健脾补肾法组小鼠按照0.1 mL/10 g体重腹腔注射8 mg/mL环磷酰胺溶液（剂量为80 mg/kg），正常对照组小鼠按照0.1 mL/10 g体重腹腔注射0.9%氯化钠注射液，每天1次，连续3天。造模结束后24 h，每组随机选取5只小鼠，眼球后静脉丛采血，用全自动血细胞分析仪进行白细胞（WBC）检测，以和正常对照组比较，WBC显著降低为模型成功标准。

1.4.2 分组及给药方法按照体重将60只雄性小鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、健脾补肾法组，每组15只。确定小鼠造模成功后，健脾补肾法组小鼠每日上下午分别按照0.2 mL/10 g体重灌胃给予2 g/ mL健脾补肾方及龟鹿二仙丹，阳性对照组小鼠每日按照0.1 mL/10g体重腹腔注射12.5 μg/mL rhG-CSF，每天1次，连续给药7天。正常对照组和模型组均按照0.2 mL/10 g体重灌胃给予纯净水。

1.4.3 外周血白细胞计数末次给药后24 h，经小鼠眼球后静脉丛采血，用装有EDTA-Na抗凝剂的采血管收集，用全自动血细胞分析仪进行白细胞检测。

1.5 细胞周期样品制备及分析细胞周期样品制备：末次给药后24 h，颈椎脱臼处死各组小鼠，取出股骨，用6号针头以1 mL PBS冲出骨髓细胞，200目筛网过滤制成单个骨髓细胞悬液。将单个骨髓细胞悬液1000 r/ min离心5 min，去上清液，用预冷PBS洗涤2次，弃上清液，加入70%预冷乙醇固定打散细胞，4℃保存待检。按文献方法，进行细胞周期分析

1.6 统计学处理采用SPSS 21.0软件进行统计分析；实验结果的数据以均数±标准差（x±s）表示；方差齐，采用方差分析，用多个实验组和对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐性要求后，用转换后的数据进行统计。若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

2 结果

2.1 健脾补肾法对骨髓抑制小鼠外周血白细胞数量的影响（见表1）

表1 健脾补肾法对骨髓抑制小鼠白细胞数量的影响（±s，♂）

表1 健脾补肾法对骨髓抑制小鼠白细胞数量的影响（±s，♂）

组别例数剂量WBC（109/L）正常对照组10-5.4±0.6模型组10-2.9±0.4**阳性对照组10125 μg·kg-1·d-15.0±0.6△△健脾补肾法组1040 g·kg-1·d-14.6±0.4**△△

采用方差分析，与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01。与正常对照组比较，模型组、健脾补肾法组的小鼠外周血WBC数量极显著下降（P＜0.01），阳性对照组的小鼠外周血WBC数量有所下降，但未见统计学差异（P＞0.05）；与模型组比较，阳性组和健脾补肾法组的小鼠外周血WBC数量极显著上升（P＜0.01）。提示，药物治疗对骨髓抑制小鼠的白细胞数量的提高有一定影响。

2.2 健脾补肾法对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期变化的影响（见表2）

表2 健脾补肾法对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期的影响（±s，♂）

表2 健脾补肾法对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期的影响（±s，♂）

注：G0/G1、S、PI采用秩和检验，G2/M采用方差分析，与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别例数剂量正常对照组10-G0/G1（%）72.16±1.48模型组10-阳性对照组10125 μg·kg-1·d-185.68±1.75**77.36±3.99△△健脾补肾法组1040 g·kg-1·d-179.50±2.23*S（%）15.42±1.76 5.55±1.77**12.02±4.80△△8.21±1.49*G2/M（%）8.22±2.21 7.15±2.07 7.82±1.60 9.44±1.0△△PI（%）24.65±2.09 12.90±1.83**20.35±4.97△△18.18±1.47△

与正常对照组比较，模型组骨髓有核细胞G0/G1期细胞比例极显著升高（P＜0.01），S期细胞比例极显著下降（P＜0.01），G2/M期细胞比例下降（P＞0.05），细胞增殖指数极显著下降（P＜0.01）；阳性对照组骨髓有核细胞G0/G1期细胞比例升高（P＞0.05），S期、G2/M期细胞比例和细胞增殖指数下降（P＞0.05）；健脾补肾法组骨髓有核细胞G0/G1期细胞比例显著升高（P＜0.05），S期细胞比例显著下降（P＜0.05），G2/M期细胞比例升高（P＞0.05），细胞增殖指数下降（P＞0.05）。

与模型对照组比较，阳性对照组骨髓有核细胞G0/ G1期细胞比例极显著下降（P＜0.01），S期细胞比例极显著上升（P＜0.01）、G2/M期细胞比例升高（P＞0.05），细胞增殖指数极显著上升（P＜0.01）；健脾补肾法组骨髓有核细胞G0/G1期细胞比例下降（P＞0.05），S期细胞比例上升（P＞0.05），G2/M期细胞比例极显著升高（P＜0.01），细胞增殖指数显著上升（P＜0.05）。

以上结果提示，健脾补肾法具有促使骨髓抑制小鼠骨髓细胞解除G0/G1期阻滞、促使G0/G1期细胞向S期细胞以及加速S期细胞向G2/M期细胞转化，从而促进骨髓细胞增殖的作用。

3 讨论

骨髓是人体重要的造血器官，骨髓产生的造血干细胞经过分化生成红细胞、白细胞、血小板、淋巴细胞等各种血细胞而发挥生理功能。骨髓对化疗药物及放射物质的高度敏感，当骨髓暴露在化疗药物及射线下时，骨髓会在细胞、分子水平上发生形态、数量以及生化等多方面的病理改变，从而造成各种骨髓有核细胞及外周血细胞数量减少、DNA断裂、染色体畸变、造血细胞功能障碍甚至细胞坏死，具体表现为骨髓有核细胞数量、DNA含量、白细胞数量下降及微核细胞率增加等改变[1]。

骨髓抑制症，中医并无此病名，但根据化疗后临床所出现症状如头晕乏力、腰膝酸软、恶心呕吐、纳差、心悸、五心烦热、寐差多梦、易外感发热及出血等症状，大多将其归为中医“血虚”“虚劳”范畴。中医学认为，药物毒邪导致气血俱虚、阴阳失和、脏腑亏损，其发生与心、肝、脾、肾等脏有关，尤其与脾肾关系最为密切[2-3]。对1989年以来相关文献研究结果表明，认为病位在脾者占83.78%，在肾者占70.27%，在脾肾者占89.19%。与肺、肝亦有一定相关性[4]。脾虚生化乏源，伤及肾本，髓失所养不能藏精化血，不能补骨生髓、藏精化血。所以益气健脾、补肾生髓为主要治疗原则。

本研究中基本方黄芪、女贞子、党参或太子参、淮山药、茯苓、白术、桑椹、菟丝子、黄精、鸡血藤、淫羊藿、肉苁蓉、山萸肉共奏健脾益肾之功。并重用血肉有情之品增强补肾生髓之功。气血不足，阴精阳气亏虚，进一步发展而致阴阳受损，使气血阴阳俱虚，此为骨髓抑制发生之根本，贯穿病症之始终；《内经》云“精不足者，补之以味”，是指对阴精不足者采用滋腻厚重、血肉有情之品以填精补阴；《临证指南医案》云“夫精血皆有形，以草木无情之物为补益，声气必不相应”。

本实验中小鼠腹腔注射环磷酰胺后骨髓有核细胞数量和DNA含量明显降低，说明环磷酰胺已对骨髓造成了急性损伤。各种血细胞对化疗药物的敏感性取决于它们的半衰期长短。白细胞半衰期最短6 h，故最易受到抑制，引起白细胞减少；在本实验中，环磷酰胺显著降低了模型小鼠外周血白细胞。应用健脾补肾药显著升高了模型小鼠白细胞的数量，表明健脾补肾法对促进造血干细胞的增殖分化有一定的作用。

细胞在周期各个时相的分布情况可以反映细胞增殖的状态，对于骨髓细胞来说，它亦是反映造血系统造血功能的重要指标之一[5]。在细胞周期调控中有两个重要的监测点，分别位于G1与S期和G2与M期之间。研究表明，细胞周期中，G2/M期对化疗的敏感性最强，其次是Go/G1期，S期对化疗药物敏感性最低。化疗造成造血细胞DNA损伤后，激活细胞周期监测点机制，将细胞周期阻滞于G1期修复损伤DNA，对不能修复者启动凋亡程序消除受损细胞[6]。本实验中，腹腔注射环磷酰胺后模型组Go/G1细胞百分比显著高于空白对照组，G2/M期细胞百分比和增殖指数显著低于空白对照组，表明环磷酰胺可以引起G1期阻滞，进而造成S期阻滞，并通过促进细胞凋亡而导致骨髓抑制。与模型组比较，健脾补肾方组Go/G1期细胞百分比显著下降，G2/ M期细胞百分比显著增加，增殖指数提高，表明使用健脾补肾法可能通过修复损伤的DNA，解除细胞周期阻滞，使受阻滞的各期细胞加速通过G1/S和S期监测点。

综上所述，本实验结果提示健脾补肾法对化疗后所致骨髓抑制有显著的改善和恢复作用。

[1]刘志辉，孟庆勇.海藻多糖对小鼠骨髓放射性急性损伤的保护作用[J].广东医学院学报，2002，20(6)：420．

[2]罗凤萍.升白汤治疗癌症化疗骨髓抑制40例疗效观察[J].山东中医杂志，2001，20（10）：593-594.

[3]林毅，司徒红林，张蓉.应用健脾补肾法结合子午流注理论治疗乳腺癌化疗后骨髓抑制症[J].新中医，2007，39（9）：94-95.

[4]马双茹，张秋平，王志刚.自拟贞芪扶正饮联合利血生、沙酐醇预防化疗所致骨髓抑制——附93例临床观察[J].中国现代实用医学杂志，2004，11，3（21、22）：57.

[5]石娅萍，黄茜，郑轶峰，等.十全大补配方颗粒对骨髓抑制小鼠骨髓细胞周期和细胞凋亡的影响[J].时珍国医国药，2011，22(6)：1515-1516.

[6]贾亮亮，奚炜，金桂兰.地榆升白片对环磷酰胺致小鼠骨髓抑制的拮抗作用[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(18)：251-254.

Influence of Jianpi Bushen Recipe on the Blood-pProdhcing Function in Mice of Myelosuppression

SONG Xinghua,LAI Maohua,LIU Hua,YE Zhengyu,XIA Xinhua
(Department of TCM,the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou 510120,China)

Objective To discuss the influence of Jianpi Bushen recipe on the blood-prodhcing function in mice of myelosuppression induced by cyclophosphamide.Methods Taking BALB/c mice 60 cases,according to the weight,60 male mice were randomly divided into normal control group,model group,positive control group and Jianpi Bushen recipe group,with 15 cases in each group.The model group,the positive control group and Jianpi Bushen recipe group were given intraperitoneal injection of 0.1 mL/10 g weight 8 mg/mL solution cyclophosphamide(dose of 80 mg/kg).The normal control group mice was given intraperitoneal injection of 0.1 mL /10 g weight 0.9%sodium chloride injection,1 time a day for three days.After the success of the building,the mice in Jianpi Bushen recipe group were given daily 0.2 mL/10 g,weight lavage for 2 g/mL Jianpi Bushen recipe gr and Guilu Erxian minipills in the morning and afternoon.The positive control group mice were given intraperitoneal injection of 0.1 mL/10 g weight 12.5 mu g/mL rhG CSF,1 time a day for seven days.The normal control group and model group were in accordance with 0.2 mL/10 g weight to fill the stomach to pure water.The last 24 h after the treatment,venous plexus after eyeball in mice blood,usedh EDTA-Na anticoagulant blood vessels of the adopt of collection,white blood cell detection using automatic blood cell analyzer.Cervical dislocation execution groups of mice,detection of bone marrow hematopoietic cell colony formation and bone marrow nucleated cells.Results Jianpi Bushen recipe method have prompted bone marrow inhibition of mouse bone marrow cells remove Go/G1phase retardation,prompted Go/G1phase to S phase cells,and accelerated the S phase cells to the G2/M phase transformation,so as to promote the role of bone marrow cell proliferation.Conclusion Jianpi Bushen recipe can significantly improve and restore function of bone marrow suppression after chemotherapy.

Jianpi Bushen recipe;myelosuppression;experimental study;consumptive disease

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.24.064

1672-2779（2016）-24-0140-03

张文娟本文校对：范萍

2016-07-05）

广州市卫生局立项项目（No：20132A011024）