补肾壮骨方治疗大鼠骨质疏松症效果的实验研究

张 鹏

（辽宁省大连普兰店市中心医院骨二科，大连116200）

补肾壮骨方治疗大鼠骨质疏松症效果的实验研究

张 鹏

（辽宁省大连普兰店市中心医院骨二科，大连116200）

目的通过运用自拟补肾壮骨方治疗骨质疏松症，观察大鼠的体重、骨密度、骨生物力学等一般情况变化，并对血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指标影响进行研究。方法采用SPF级雌性大鼠，80只，按体重进行分层随机分为正常组、模型组、补肾壮骨方治疗组、阿仑膦酸钠阳性药物观察组。采用摘除卵巢对非正常组大鼠进行骨质疏松症造模，正常组和模型组给予1 mL/100 g的生理盐水，日2次，灌胃；补肾壮骨方治疗组给予补肾壮骨中药汤剂（1 mL/100 g，1 mL含1 g生药），日2次，灌胃；阿仑膦酸钠阳性药物观察组给予阿仑膦酸钠溶液（1 mL/100 g，1 mL含0.74 mg药粉），日2次，灌胃。连续灌胃3个月。观察大鼠股骨重量、骨密度变化、骨生物力学变化、血清OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3等指标变化。结果大鼠股骨重量骨密度变化；骨生物力学变化；血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指标；实验后，与正常组比较，模型组大鼠各项指标改变明显（P＜0.05），差异具有统计学意义；补肾壮骨中药治疗组、阿仑膦酸钠阳性药物观察组与模型组大鼠比较，均改善明显（P＜0.05），补肾壮骨方治疗组与阿仑膦酸钠观察组比较股骨重量（右侧）、骨生物力学、血清OCN、PICP、血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3变化明显（P＜0.05），具有统计学意义，骨密度变化不明显（P＞0.05），差异无统计学意义。结论补肾壮骨中药治疗骨质疏松症模型大鼠效果明显，能够改善大鼠股骨重量、骨密度、骨生物力学、血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等，通过多靶点、多途径的促进骨细胞增殖，骨形成与重建，骨钙磷代谢。

补肾壮骨方；骨质疏松症；摘除卵巢大鼠骨质疏松症模型；实验研究

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是骨科临床中常见的疾病，其病因复杂多样，发病率较高，尤其中老年人发生率更高。随着我国人口老年化的来临，我国骨质疏松症将迎来发生率的高峰[1]。西医仅以补钙作为主要治疗方法，疗效不佳。本研究通过运用自拟补肾壮骨方治疗骨质疏松症（摘除卵巢大鼠骨质疏松症模型），观察大鼠骨密度、骨生物力学变化、血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指标水平的变化，报告如下：

1 实验材料

1.1 实验动物SPF级，雌性大鼠，80只，体重(200± 20)g，辽宁中医药大学动物实验中心提供，合格证号：SCXI（辽）ISO010-0001。

1.2 实验药物（1）补肾壮骨汤是由《十药神书》中补髓丹和《活人心统》中的河车大造丸化裁而成，主要组成为猪骨髓30 g，紫河车20 g，阿胶20 g，牛膝15 g，杜仲15 g，熟地黄20 g，补骨脂15 g，淫羊藿15 g。所用中药由辽宁中医药大学动物实验中心提供。将猪骨髓、紫河车、牛膝、杜仲、熟地黄、补骨脂、淫羊藿等中药浸泡30 min，煎煮30 min后取汤，加水再次煎煮30 min，再次取汤，将两次所取汤药混合，加热，浓缩，加入阿胶粉。所有制备中药汤剂存放于4℃冰箱中贮存备用。

（2）阿仑膦酸钠（福善美）：片剂，杭州默沙东制药有限公司生产，国药准字：H20080073。

1.3 主要试剂及设备OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3检测试剂盒(美国R&D公司，批号：201409）。无水乙醇、甲醛、戊巴比妥钠等试剂，所有试剂由辽宁中医药大学动物实验中心提供。酶标仪(奥地利)型号：Anthos 2010；37℃电热恒温培养箱(上海博讯医疗设备公司)型号:HXP-9052MBE；离心机(法国Jouan)型号:C4-12；微量移液器(美国热电)；电子秤(上海精密仪器有限公司)型号:JY5022；双能X线骨密度测定仪(美国GE公司）型号：LUNAR-Prodigy生物力学实验机(美国MTS-858型)。

2 实验方法

2.1 造模方法根据大鼠体重，取3%戊巴比妥钠溶液进行腹腔注射，注射标准为0.2 ml/100 g。麻醉后进行卵巢摘取，全程无菌操作，于大鼠剑突下约1.5 cm处，沿腹白线进行纵向切割，切口约2 cm，剥离腹部肌肉及腹膜，充分暴露腹腔，确定子宫下角位置并向上找寻卵巢，结扎输卵管及周围血管组织，防止出血。正常组切除卵巢周围脂肪组织，其他组摘除双侧卵巢。止血、缝合、并做好预防感染（术后肌肉注射20万单位的青霉素，连续5天），擦涂云南白药于手术切口。造模后观察1周，期间自由饮水进食，一周后进行正式药物实验。

2.2 分组及处理采用SPF级雌性大鼠，80只，于通风、洁净、安静的环境下适应性喂养一周，期间自由饮水进食，一周后进行称重。按体重进行分层随机分为正常组、模型组、补肾壮骨方治疗组、阿仑膦酸钠阳性药物观察组，造模成功后进行正式实验。正常组和模型组给予1 mL/100g的生理盐水，日2次，灌胃；补肾壮骨方治疗组给予补肾壮骨中药汤剂（1 mL/100 g，1 mL含1 g生药），日2次，灌胃；阿仑膦酸钠阳性药物观察组给予阿仑膦酸钠溶液（1 mL/100 g，1 mL含0.74 mg药粉），日2次，灌胃。连续灌胃3个月。

2.3 观察指标股骨重量：实验结束停药24 h后，处死大鼠，摘取大鼠右侧股骨，称取重量。骨密度：采用双能X线骨密度测定仪，对取材进行BMD分析。骨生物力学变化：应用MTS-858型生物力学实验机进行骨生物力学的检测。大鼠血清OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3：取大鼠股动脉血液5 mL左右，送往辽宁中医药大学血液检测实验室进行离心，分离血清和红细胞，采用ELISA法进行血清OCN、PICP、25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3检测。

2.5 统计分析采用SPSS17.0统计软件处理，数据用均数±标准差（±s），两组间数据比较采用单因素方差分析。

3 实验结果

大鼠股骨重量骨密度变化；骨生物力学变化；血清OCN、PICP、25-(OH)D3，1，25-(OH)2D3等指标，实验后，与正常组比较，模型组大鼠各项指标改变明显（P＜0.05），具有统计学意义；补肾壮骨中药治疗组、阿仑膦酸钠阳性药物观察组与模型组大鼠比较，均改善明显（P＜0.05），补肾壮骨方治疗组与阿仑膦酸钠观察组比较股骨重量（右侧）、骨生物力学、血清OCN、PICP、血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3变化明显（P＜0.05），具有统计学意义，骨密度变化不明显（P＞0.05），差异无统计学意义。

3.1 股骨重量（右侧）具体结果见表1。

表1 股骨（右侧）指数变化

3.2 骨密度具体结果见表2。

表2 骨密度变化（±s）

表2 骨密度变化（±s）

注：△表示与正常组比较P＜0.05；☆表示与模型组比较P＜0.05

组别例数股骨上端股骨下端正常组模型组中药组西药组19 20 19 20 0.168±0.009 0.131±0.012△0.165±0.015☆0.165±0.011☆0.184±0.016 0.141±0.013△0.190±0.008☆0.185±0.019☆股骨全部0.147±0.013 0.126±0.018△0.153±0.013☆0.153±0.012☆

3.3 骨生物力学具体结果见表3。

表3 骨生物力学变化（±s）

表3 骨生物力学变化（±s）

注：△表示与正常组比较P＜0.05；☆表示与模型组比较P＜0.05

组别例数最大载荷（N）正常组模型组中药组西药组19 20 19 20 135.03±4.71 83.06±5.03△130.05±4.70☆114.02±4.96☆刚度（N/mm）230.58±6.92 155.85±7.64△195.95±7.12☆177.78±8.21☆

3.4血清OCN、PICP的影响具体结果见表4。

表4 血清OCN、PICP变化（s）

表4 血清OCN、PICP变化（s）

注：△表示与正常组比较P＜0.05；☆表示与模型组比较P＜0.05

组别例数OCN（ng/ml）正常组模型组中药组西药组19 20 19 20 6.412±1.031 4.053±1.132△6.351±1.011☆6.741±0.993☆PICP（ng/ml）9.655±0.899 8.249±0.959△9.901±0.791☆9.255±0.949☆

3.5 血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3的影响具体结果见表4。

表5 血清25(OH)D3、1，25(OH)2D3变化（±s）

表5 血清25(OH)D3、1，25(OH)2D3变化（±s）

注：△表示与正常组比较P＜0.05；☆表示与模型组比较P＜0.05

组别例数25(OH)D3（ng/L）正常组模型组中药组西药组19 20 19 20 429.88±15.45 415.07±23.01 447.22±39.87 439.04±20.55 1,25(OH)2D3（ng/ml）586.32±38.19 493.99±55.01▲604.03±42.99★590.11±36.74★

4 讨论

本研究结果表明：①股骨重量（右侧）提示补肾壮骨方具有补肾生精壮骨的作用，能够充实肾脏，壮实股骨。肾主骨，补肾壮骨方中还有补肾中药，故肾气与肾精充盛，精能生髓，髓能壮骨，肾精盛则股骨壮。②骨密度的检测能够充分反映机体内骨矿物的含量，直接、客观的判断药物疗效[2]。补肾壮骨汤能够增加机体内骨矿物质的含量，增加机体内钙质的含量。③骨生物力学为评价骨质量的重要指标，能够充分反映骨质量的水平。摘除大鼠双侧卵巢后，性激素生成代谢紊乱，胶原纤维的合成减少，骨形成能力下降，骨力学强度下降、脆性上升，易发骨折[3]。补肾壮骨汤治疗组效果显著，可能参与抑制骨吸收、促进骨增殖、增加胶原蛋白。④OCN是一种非胶原蛋白质激素样多肽，是非增殖期成骨细胞合成分泌的，其水平和骨组织水平呈正相关关系，能够直接反应骨细胞的活性和相关代谢变化[4]。阿仑膦酸钠阳性药物对照组与补肾壮骨汤能够影响机体骨细胞的改变和钙的代谢，改善骨骼发育。⑤PICP能够反映OP病理改变、疗效机制、诊断疾病、判断疾病发展等[5]。补肾壮骨汤能够改善PICP的水平，提高骨细胞活性，促进骨形成，抑制破骨细胞，从而达到抗OP的效果。⑥25-(OH)D3水平能够准确反映机体内维生素D的水平，25-(OH)D3也和BMD呈正相关关系[6]。⑦1，25-(OH)2D3是肾脏近端肾小管内经过25-(OH)D-1α-羟化酶的又一次转化形成的[7]。另外胎盘和巨噬细胞也能够合成少量的1，25-(OH)2D3[8]。1，25-(OH)2D3能够同时调节成骨细胞和破骨细胞，同时参与骨形成和骨代谢的两个变化，对骨具有双向调节功用，若其发生改变造成骨吸收的增多则平衡破坏，发生OP。补肾壮骨汤能够通过调节血清25-(OH)D3、1，25-(OH)2D3水平，改善机体体内骨形成与吸收的平衡，达到治疗目的。

综上所述，《十药神书》中补髓丹和《活人心统》中的河车大造丸化裁而成的自拟补肾壮骨汤能够改善骨质疏松大鼠各项指标，从不同角度、不同途径起到治疗作用，值得应用于临床。

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Experimental Study on the Effect of Bushen Zhuanggu Decoction in the Treatment of Osteoporosis Rats

ZHANG Peng
(Department of Orthopedics,Pulandian Central Hospital,Liaoning Province,Dalian 116200,China)

Objective By using self-made Bushen Zhuanggu decoction in the treatment of osteoporosis,to observe generally changes of rats weight,bone mineral density,bone biomechanics,and to study the indexes of Serum Osteocalcin(OCN),PICP and 25-(OH)D31,25-(OH)2D3etc.Methods 80 female rats of SPF,according to body weight,were randomized to normal group,model group,Bushen Zhuanggu decoction treatment group and alendronate sodium positive drug observation group.The introduction of ovariectomized rats in the non normal group of osteoporosis rats,normal group and model group were given physiological saline 1ml/ 100g,2 times a day,gavage.Bushen Zhuanggu decoction treatment group was given Bushen Zhuanggu Chinese medicine decoction (1ml/100g,1ml contains 1g crude drug),2 times a day,gavage.Alun phosphonic acid sodium positive drug observation group was treated with alendronate sodium solution(1ml/100g,1ml contains 0.74mg powder),2 times a day,gastric lavage.The treatment continued irrigation for 3 months.The changes of the weight,bone mineral density,bone biomechanical changes,serum OCN,PICP, 25-(OH)D3,1,25-(OH)2D3and other indexes in rats were observed.Results The changes of rat femur weight bone density,bone biomechanics,serum OCN,PICP,25-(OH)D31,25-(OH)2D3index after experiment were compared with the normal group,the indexes of model group rats changed significantly(P＜0.05),and there was statistical significance.The Bushen Zhuanggu treatment group and the alendronate positive drug observation group was compared with the model group,and the improvement was significant (P＜0.05).Bushen Zhuanggu decoction treatment group and alendronate observation group was compared the weight of femur (right),bone biomechanics,serum OCN,serum PICP,25-(OH)D3,1,25-(OH)2D3,changes were significant(P＜0.05),and there was statistical significance,but bone density did not change significantly(P＞0.05),there was no statistical significance. Conclusion The Bushen Zhuanggu Chinese medicine in the treatment of osteoporosis model rats has obvious effect,can improve the rat bone weight,bone density,bone biomechanics,Serum Osteocalcin(OCN),PICP and 25-(OH)D31,25-(OH)2D3,through multiple targets and multiple ways to promote the proliferation of bone cells,bone formation and reconstruction,bone calcium and phosphorus metabolism.

Bushen Zhuanggu decoction;osteoporosis;ovariectomized rat model of osteoporosis;experimental study

10.3969/j.issn.1672-2779.2016.24.066

1672-2779（2016）-24-0145-03

张文娟本文校对：侯长福

2016-08-11）