PI3K/Akt信号传导通路在乙醛刺激下大鼠肝星状细胞株HSC-T6增殖中的作用

张迪，程敏，康馨丹，陈卫刚，郑勇

(1 石河子大学医学院，新疆石河子832002；2 石河子大学第一附属医院)



PI3K/Akt信号传导通路在乙醛刺激下大鼠肝星状细胞株HSC-T6增殖中的作用

张迪1，程敏1，康馨丹1，陈卫刚2，郑勇2

(1 石河子大学医学院，新疆石河子832002；2 石河子大学第一附属医院)

目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号传导通路在乙醛刺激的大鼠肝星状细胞株HSC-T6增殖中的作用。方法 将大鼠HSC-T6随机分为6组：空白对照组(A组)：采用10%胎牛血清的DMEM培养液培养；乙醛组(B组)：在A组基础上加乙醛，使终浓度为200 μmol/L；实验组在B组基础上加入不同浓度(25、50、75、100 μmol/L)的PI3K/Akt通路抑制剂LY294002，分别称为C、D、E、F组。用CCK-8法检测大鼠HSC-T6增殖活力(用A值表示)。再随机将HSC-T6分为3组：空白对照组(10%胎牛血清的DMEM培养液培养)、乙醛组(在空白对照组基础上加乙醛，使终浓度为200 μmol/L)、乙醛+LY294002组(在乙醛组的基础上加入50 μmol/L LY294002)，用Western blotting法检测大鼠HSC-T6中PI3K、p-Akt蛋白的表达情况。结果 A、B、C、D、E、F组A值分别为0.545 0±0.024 4、0.952 3±0.045 5、0.927 3±0.041 9、0.865 8±0.028 9、0.814 3±0.024 7、 0.759 3±0.220 0。与A组比较，其他各组A值均升高；与B、C组比较，D、E、F组降低(P均<0.01)。与空白对照组比较，乙醛组、乙醛+LY294002组PI3K、p-AKT蛋白相对表达量高(P均<0.01)，与乙醛组比较，乙醛+LY294002组降低(P<0.05)。结论 PI3K/Akt信号传导通路部分参与调控乙醛刺激的大鼠HSC-T6增殖。

肝纤维化；肝星状细胞；乙醛；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号传导通路；LY294002

肝硬化是临床常见的一种慢性肝病，其病理基础是肝纤维化[1]。酒精性肝纤维化是由于过量摄入乙醇导致肝脏发生肝纤维化及其引起的一系列病理变化。因此，酒精性肝损伤是造成肝纤维化的主要病因。乙醇本身不具有毒性，但其代谢产物乙醛却可刺激肝星状细胞(HSC)活化[2，3]。HSC是肝纤维化时过量细胞外基质(ECM)的主要来源, 激活的HSC大量增殖,发生表型改变并分泌过多的ECM沉积于肝脏，故目前认为HSC的活化与增殖是肝纤维化进展的重要环节[4]。 已有研究证实，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号传导通路是HSC活化与增殖导致肝纤维化发生的主要信号传导通路[5]。但近年来PI3K/Akt信号传导通路在乙醛刺激的HSC增殖中的作用报道较少。2016年3月1日～8月15日，我们进行了相关探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞系：大鼠HSC-T6细胞株(广州吉妮欧生物科技有限公司)。药品与试剂：胎牛血清、DMEM低糖培养基(美国Hyclone公司 )；LY294002(美国Sigma公司)；CCK-8(东仁化学科技有限公司)；兔抗PI3K p110α单隆抗体、p-Akt(Ser473)单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)；小鼠抗β-actin单克隆抗体、山羊抗兔IgG/辣根酶标记二抗、山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记二抗(北京中杉金桥有限公司)；化学发光试剂盒(美国Thermo公司)；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养、分组及处理 大鼠HSC-T6以2×105/mL接种于含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基培养。细胞6～8 h贴壁生长，24～48 h换液1次，待细胞增殖达到90%融合度时，用0.25%胰酶消化，将对数生长期的细胞1∶2传代接种。将大鼠HSC-T6随机分为6组：空白对照组(A组)：采用10%胎牛血清的DMEM培养液培养；乙醛组(B组)：在A组基础上加乙醛，使终浓度为200 μmol/L；实验组用不同浓度(25、50、75、100 μmol/L)的LY294002预处理1 h后再加入乙醛，分别称为C、D、E、F组。

1.3 大鼠HSC-T6增殖活力的检测 采用CCK-8法。将大鼠HSC-T6用胰酶消化成悬浮状态，调整细胞数至4×105/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞悬液100 μL，每组4个复孔，细胞生长至80%以上融合度时，用含0.4%胎牛血清的DMEM同步化处理24 h。实验组用不同浓度的LY294002预处理1 h后，加入200 μmol/L(终浓度)的乙醛100 μL，放置CO2培养箱中继续孵育24 h(乙醛每12 h补充一次)，弃去旧的培养基，每孔加入CCK-8 10 μL，置于37 ℃、5% CO2培养箱内反应75 min后用酶标仪，单波长测定每孔吸光度(A)值，测定波长为460 nm。

1.4 HSC-T6中PI3K、p-AKT蛋白相对表达的检测 采用Western blotting法。将HSC-T6随机分成空白对照组(10%胎牛血清的DMEM培养液培养)、乙醛组(在空白对照组基础上加200 μmol/L乙醛3 mL)、乙醛+LY294002组(加入50 μmol/L的LY294002作用1 h后，再加入200 μmol/L乙醛3 mL)，加入细胞裂解液，提取蛋白，统一蛋白浓度为40 g/L，蛋白变性后待用。加样量每孔7 μL，总蛋白经SDS-PAGE分离后,转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭2 h，检测PI3K时加入兔抗鼠一抗(1∶2 000), 检测p-Akt时加入兔抗一抗(1∶1 000)，加入β-actin鼠抗鼠一抗(1∶1 000)，4 ℃冰箱过夜, 1×TBST洗5次, 5 min/次, 再各加入山羊抗兔二抗(1∶20 000), β-actin加入山羊抗鼠二抗(1∶20 000)，常温下孵育2 h, 再用1×TBST洗5次, 5 min/次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色,暗室曝光到X线片上,显影、定影后将胶片置于凝胶成像进行定量分析, 计算目的蛋白灰度值与β-actin蛋白灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 6组HSC-T6增殖活力比较A、B、C、D、E、F组A值分别为0.545 0±0.024 4、0.952 3±0.045 5、0.927 3±0.041 9、0.865 8±0.028 9、0.814 3±0.024 7、 0.759 3±0.220 0。与A组比较，其他各组A值均升高(P均<0.01)；与B、C组比较，D、E、F组降低(P均<0.01)。

2.2 3组HSC-T6内PI3K、p-AKT蛋白相对表达量比较 见表1。

表1 3组HSC-T6内PI3K、 p-Akt蛋白相对表达量比较

注：与空白对照组比较,#P<0.01；与乙醛组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

肝纤维化是肝脏慢性损伤后ECM可逆性沉积的创伤愈合过程，HSC是过量ECM的主要来源[6]。在各种因素作用下，HSC自身可产生多种细胞因子与活化产物，这些因子可以通过各种信号通路调节HSC 的功能，PI3K/Akt 是其中重要的一条信号通路[7]。LY294002作为PI3K/Akt信号通路的特异性阻断剂，可抑制HSC增殖，并诱导HSC凋亡发生，从而抑制肝纤维化的发展[8，9]。

本研究中，用200 μmol/L的乙醛预处理大鼠HSC-T6模拟体外酒精性肝纤维化实验模型后，分别加入不同浓度的LY294002，实验结果显示乙醛预处理的HSC-T6增殖均受到抑制，且随着LY294002浓度的增大，抑制作用逐渐增强，说明阻断PI3K/Akt信号传导通路能有效抑制乙醛诱导的大鼠HSC-T6增殖，促进大鼠HSC-T6凋亡，减少ECM分泌，从而起到延缓酒精性肝纤维化进程的作用，同时为酒精性肝纤维化的治疗提供了新的思路。

由于各个浓度的LY294002对大鼠HSC-T6均有毒性作用，高浓度LY294002可影响大鼠HSC-T6的形态，而低浓度的LY294002对HSC增殖的抑制作用又不明显，因此，我们选用50 μmol/L的LY294002用于Western blotting试验，检测大鼠HSC-T6中PI3K/Akt信号通路上游蛋白PI3K、p-Akt的表达情况。实验结果显示，与空白对照组比较，乙醛组PI3K、p-Akt蛋白表达增加，说明在乙醛刺激大鼠HSC-T6增殖的过程中，可能影响了PI3K/Akt信号传导通路，增强了PI3K蛋白的表达，继而使Akt磷酸化增加，p-Akt蛋白表达增强。同时，与乙醛组比较，乙醛+LY294002组PI3K、p-Akt蛋白表达降低，提示当向体外酒精性肝纤维化模型中加入PI3K/Akt信号通路抑制剂阻断该通路后，该通路上的两个上游蛋白表达均受到抑制，这说明PI3K/Akt信号通路可能与酒精性肝纤维化的发生发展过程有关。

但值得注意的是，本实验虽然使用了PI3K/Akt信号通路的特异性抑制剂，但是仍不能完全抑制乙醛对HSC-T6增殖的刺激作用，同时也不能完全降低PI3K、p-Akt蛋白的表达量，本研究分析产生这种结果的原因可能有以下两点：①PI3K/Akt信号通路并非是调控乙醛刺激的HSC-T6增殖活性的惟一通路。众所周知，细胞外刺激引起细胞反应是通过细胞内信号传导途径来实现的，不同的信号传导途径引起不同的生物学效应，这些信号通路之间存在着交互作用而非独立，众多细胞信号通路网络交互影响, 共同介导肝纤维化复杂的病理生理变化。也就说，即使阻断了PI3K/Akt信号通路，但仍有其他信号通路作用于大鼠HSC-T6，刺激大鼠HSC-T6的活化与增殖，进而促进肝纤维化的形成。②实验中所使用的最高浓度LY294002(100 μmol/L)并没有达到完全阻断PI3K/Akt信号通路的最终药物浓度。故出现了实验组中HSC的增殖能力强于空白对照组，PI3K、p-Akt蛋白的表达量高于空白对照组这一结果。后期可以通过增大LY294002的浓度，看是否可以找到一个临界浓度能够完全抑制乙醛预处理的大鼠HSC-T6的增殖，来进一步探讨PI3K/Akt信号通路与乙醛刺激的大鼠HSC-T6增殖、凋亡之间可能存在的关系。

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Effects of PI3K/Akt signaling pathway on acetaldehyde-stimulated proliferation of hepatic stellate cells HSC-T6

ZHANGDi1,CHENMin,KANGXindan,CHENWeigang,ZHENGYong

(1GraduateSchoolofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832002,China)

Objective To investigate the effects of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathway specific inhibitor LY294002 on the proliferation of rat hepatic stellate cells (HSC-T6) stimulated by acetaldehyde. Methods The rat HSC-T6 cells were randomly divided into six groups: the blank control group (group A): we used DMEM culture solution with 10% fetal bovine serum (FBS) to culture, the acetaldehyde group (group B): we added acetaldehyde on the basis of the blank control group and made the final concentration be 200 μmol/L, the experimental group was added with different concentrations of PI3K/Akt pathway specific inhibitor LY294002 (25, 50, 75 and 100 μmol/L) on the basis of acetaldehyde group (group B), and then they were named groups C, D, E and F, respectively. CCK-8 was applied to detect the proliferation activity of rat HSC-T6 cells. And then HSC-T6 cells were randomly divided into three groups: the blank control group (added with DMEM culture solution with 10% fetal bovine serum), acetaldehyde group (added with acetaldehyde on the basis of blank control group and made the final concentration be 200 μmol/L), and acetaldehyde+LY294002 group (added with 50 μmol/L PI3K/Akt pathway specific inhibitor LY294002 on the basis of acetaldehyde group). Western blotting was used to detect the expression of PI3K and p-Akt protein in rat HSC-T6. Results The A values of groups A, B, C, D, E, and F were 0.545 0±0.024 4, 0.952 3±0.045 5, 0.927 3±0.041 9, 0.865 8±0.028 9, 0.814 3±0.024 7 and 0.759 3±0.220 0, respectively. Compared with group A , the A values of other groups all increased; compared with groups B and C, the A values of groups D, E and F all decreased (allP<0.01). Compared with the blank control group, the protein expression of PI3K and p-Akt in acetaldehyde group and acetaldehyde+LY294002 group were increased (allP<0.01). Compared with the acetaldehyde group, the value of acetaldehyde+LY294002 group decreased (P<0.05). Conclusion PI3K/Akt signaling pathway may partly adjust and control the proliferation of rat HSC-T6 stimulated by acetaldehyde.

hepatic fibrosis; hepatic stellate cell; acetaldehyde; phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathway; LY294002

国家自然科学基金资助项目(81170402)。

张迪(1990-)，女，硕士，主要研究方向为慢性肝病及消化道肿瘤的临床及基础。E-mail:351065129@qq.com

郑勇(1956-)，男，博士，教授，主要研究方向为慢性肝病及消化道肿瘤的临床及基础。E-mail:zy2850@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.002

R575.2

A

1002-266X(2016)45-0006-03

2016-08-22)