杂交构树组培快繁体系的建立

刘 芸，郭龙妹，任淼辉，田双梅

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.佳县农业技术推广中心，陕西佳县719200）

杂交构树组培快繁体系的建立

刘 芸1，郭龙妹1，任淼辉1，田双梅2

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷030801；2.佳县农业技术推广中心，陕西佳县719200）

通过对杂交构树的组织培养，研究不同的灭菌方法和激素配比对愈伤组织的诱导、芽的增殖、壮苗及生根的影响。结果表明，最佳灭菌剂为0.5%的HgCl2，灭菌15 min后除菌率达到68.2%；诱导愈伤组织分化的最佳培养基为MS＋1.5 mg/L6-BA＋1.0 mg/LNAA＋0.8%琼脂＋3%蔗糖；最佳壮苗培养基为MS＋1.5 mg/L6-BA＋0.2 mg/L NAA＋0.8%琼脂＋3%蔗糖；最佳生根培养基为1/2 MS＋0.5 mg/L6-BA＋1.0 mg/LNAA＋0.8%琼脂＋3%蔗糖；移栽的最佳基质为蛭石，移栽后成活率达到88%。

杂交构树；组织培养；快繁

杂交构树（Broussonetia papyrifera L.）为桑科构属落叶乔木，又名鹿仔树、榖浆树，是构树优良种源的杂交种，在我国的温带、热带均有分布。其适应性强，抗逆性强，生长迅速，耐旱、耐盐、耐碱，在瘠薄土地均能生存，是良好的经济林和生态林品种，具有很高的利用价值[1]。现代研究表明，构树叶总黄酮具有抑菌抗癌防腐的作用[2-4]；其果实楮实子具有清肝明目、补肺益肾之功效，所含有的红色素及提取物具有不同程度的抗氧化作用[5]；构树纤维表面光滑，部分纤维还有不明显的转曲，具有类似苎麻的横纹，可广泛用于造纸产业及新型纺纱材料等领域[6-7]；其还具有吸附空气中的有害气体和滞尘等功能，是较为优良的生态保健园林绿化树种[8]。戚亚伟等[9]研究表明，构树叶对养分过剩而导致的小鼠肥硕有治疗效果，并能促进其油脂减少，改变内脏脂肪变性。

王克荣等[10]研究表明，蔬菜害虫能被构树叶汁液有效地杀死，可以用构树叶开发出天然生物杀虫剂。瞿晓晶等[11]研究表明，构树种子油对羟基自由基的抑制率高达93.56%。构树子还具有壮筋健骨，清热明目的功效，可用于治疗腰膝不适，肾亏目昏。此外，构树叶还可以代替苜蓿草粉和豆粕做成饲料添加在牛羊等的日粮中[12]。其树皮、木材、叶、花、果实、种子、根、乳汁等皆可综合利用，经济效益潜力很大[13]。目前，构树苗木主要靠常规的无性扦插繁殖，但由于材料来源不足，扦插成活率不高，费时费工，难以满足当前大面积栽培及推广的需要[14]。由于构树具有巨大的利用价值，其需求量也在日趋增加，但杂交构树在自然条件下生长周期较长，远不能满足社会的需求，而利用组织培养快繁技术能很好地解决构树资源短缺的问题。

本试验通过优化灭菌方法和激素配比，进行愈伤组织、芽及根的诱导，建立了构树的组织培养体系，旨在为构树的大量快繁奠定基础，同时，也可减轻对构树野生资源的采挖和破坏，实现良好的生态效益。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为生长健壮、无病害的构树叶片，由山西清徐科尔沁构树种植基地提供。

1.2 试验方法

1.2.1 试验条件 以MS培养基为基本培养基，改变激素种类、浓度及添加琼脂、蔗糖形成不同培养基组合，并于光照时间为12 h、光照强度为2 500 lx、培养温度为（25±2）℃的条件下对试验材料进行培养。

1.2.2 试验材料的获取及消毒 将洗干净的构树叶片用75%乙醇溶液浸泡30 s，经无菌水冲洗2～3次，置于灭菌液中灭菌，并设置空白对照。灭菌液分别为9%Ca（ClO）2，0.5%HgCl2和10%H2O2，灭菌时间分别设定为5，10，15 min。灭菌完成后记录叶片的死亡率，并用无菌水冲洗4～10次，沥干水后迅速将叶片接种到培养基中，每瓶接种3～4个，10瓶为一组，共接种9组，光照培养室中培养7 d后统计叶片的污染率和成活率。

1.2.3 愈伤组织及芽苗的诱导 以MS＋0.8%琼脂＋3%蔗糖为基础培养基，加入不同质量浓度的6-BA和NAA。6-BA采用0.5，1.0，1.5 mg/L等3个水平，NAA采用0.5，1.0，1.5 mg/L等3个水平。将叶片切成1 cm2左右的正方形，接入培养基中进行培养。每个水平接种20瓶，每瓶3块叶片，培养20 d后观察并记录愈伤组织及芽苗的生长情况。

1.2.4 壮苗培养基的筛选 以MS＋0.8%琼脂＋3%蔗糖为基础培养基，加入不同质量浓度的6-BA和NAA。6-BA设置1.0，1.5，2.0 mg/L等3个水平，NAA设置0.10，0.15，0.20 mg/L等3个水平。选择长势较好的基础苗进行壮苗，每个水平做15瓶，每瓶插1～2株。接种后置于光照培养室中，20 d后观察并记录壮苗结果。

1.2.5 构树生根培养基的筛选 以1/2 MS＋0.8%琼脂＋3%蔗糖为基础培养基，加入不同质量浓度的6-BA和NAA。6-BA采用0.5，1.0，1.5 mg/L等3个水平，NAA采用0.2，0.3，0.4，0.5 mg/L等4个水平。每瓶接种1～2个幼苗，每个水平接种15瓶，培养15 d后观察并记录构树健壮幼苗的生根情况。

1.2.6 构树的驯化移栽 将长有构树幼苗的培养瓶转移至半遮阴的自然光下，2～3 d后开口炼苗。将营养钵中装入蛭石和珍珠岩，洗干净幼苗根部黏附的培养基后，将幼苗移入营养钵中并浇足水。用塑料薄膜为幼苗搭建小拱棚并喷雾保湿，同时注意通风，随后逐渐降低湿度，15 d后揭去棚膜，让幼苗在自然条件下生长。

2 结果与分析

2.1 消毒剂及消毒方法的比较

从表1可以看出，灭菌效果最好的处理是75%乙醇溶液浸泡30 s后，再用0.5%HgCl2灭菌15 min，除菌率可以达到68.2%，外植体的成活率可达43.6%。

表1 不同消毒方法对构树叶片消毒效果的比较

2.2 诱导愈伤组织及芽苗培养基的筛选

表2 不同培养基对愈伤组织的诱导效果

构树叶片在愈伤组织诱导培养基中培养20 d后，观察不同浓度激素比例下叶片的增殖倍数与芽苗高度等生长状况。由表2可知，对愈伤组织的影响较大的激素为6-BA，当6-BA质量浓度逐渐增大时，芽的增殖倍数逐渐变大，当6-BA质量浓度为1.5 mg/L、NAA质量浓度为1.0 mg/L时，增殖倍数为5.4，愈伤组织分化效果最明显。因此，诱导愈伤组织分化的最佳培养基配方为MS＋1.5 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋0.8%琼脂＋3%蔗糖。芽苗增殖结果如图1-a所示。

2.3 构树壮苗培养基的筛选

从表3可以看出，分析可得对壮苗影响较大的激素为6-BA，当6-BA质量浓度为1.5 mg/L，NAA质量浓度为0.2 mg/L时，壮苗效果最明显，此时株高为3.6 cm。由此可得壮苗效果最佳的培养基配方为MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.20 mg/L NAA＋0.8%琼脂＋3%蔗糖。壮苗结果如图1-b所示。

表3 不同培养基对构树壮苗的诱导效果

2.4 生根培养基的筛选

接种至生根培养基12 d后可以看到根原基分化出的愈伤组织，15 d后可看到诱导出的细小不定根。从表4可以看出，当6-BA质量浓度为0.5 mg/L、NAA质量浓度为1.0 mg/L时，根的生长情况最好，此时根原基的发生率为93%。由此可以得出，最佳的生根培养基为1/2 MS＋0.5 mg/L6-BA＋1.0 mg/L NAA＋0.8%琼脂＋3%蔗糖。生根结果如图1-c所示。

表4 不同培养基对构树生根的诱导效果

2.5 构树幼苗的驯化移栽

从表5可以看出，构树幼苗在移栽到蛭石中的成活率高于珍珠岩，在珍珠岩中，叶片失水严重，苗木萎蔫，生长不良；而蛭石中的幼苗则生长良好，移栽25 d后，长高3～5 cm，叶片明显变大且长出1～2条新根，原来的根伸长1～2 cm。

表5 不同基质对构树试管苗移栽后成活率的影响

3 讨论与结论

无菌材料是植物组培快繁的前提，对叶片进行消毒时，时间过长可能会对材料造成毒害，影响叶片的生命活力；时间过短可能会造成消毒不彻底。本试验的最佳灭菌方法为0.5%的HgCl2处理15 min，在考虑选择何种灭菌剂的同时，还综合考虑了灭菌时间对灭菌效果的影响，与宋丽红[15]及刘中兵[16]的研究思路接近。但也有研究认为，构树叶片外植体最佳消毒方法是0.1%的HgCl2（加吐温80）和0.5%次氯酸钠的二次灭菌法[17]，这可能是由于试验材料的来源不同及其生长环境的差异，导致材料所带的微生物不同，从而需要灭菌的强度也有所差异。

在组织培养中，生长素类物质的主要作用是促进新梢生长，诱导外植体产生愈伤组织及促进培养组织的延伸生长；细胞分裂素类物质的主要作用是促进细胞的分裂和分化，诱导胚状体和不定芽的形成。在离体条件下，器官的诱导并不是由某种生长激素的浓度所决定，而是为那些参与分化的物质间的比例关系所决定，当6-BA与NAA的比例低时有利于愈伤组织的形成和芽的生长；比例高时有利于芽的分化[18-20]。本试验研究结果表明，诱导愈伤组织分化时6-BA与NAA的适宜比例为3∶2；壮苗时6-BA与NAA的适宜比例为15∶2；生根时6-BA与NAA的适宜比例为1∶2，与其他文献中报道的生长激素使用比列相符合。

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Establishment of Tissue Culture and Rapid Propagation System of HybridBroussonetia papyrifera

LIUYun1，GUOLongmei1，RENMiaohui1，TIANShuangmei2
（1.College ofLife Sciences，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Jiaxian CountyAgricultural TechnologyExtension Center，Yulin Gity，Jiaxian 719200，China）

Based on tissue culture of hybrid Broussonetia papyrifera,this paper studied on the effect of different factors,such as different sterilization treatments and combinations of plant growth regulators.The result showed that the appropriate sterilant agent was 0.5%HgCl2,the sterilization rate reached 68.2%after 15 min sterilization.The most suitable medium for callus differentiation consisted of MS＋1.5 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋0.8%agar+3%sugar;MS＋1.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA＋0.8%agar＋3%sugar was the optimum for strong seedling cultivation;and the best rooting medium was 1/2 MS＋0.5 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋0.8%ager＋3%sugar.The best growth substrate for transplant was vermiculite,the survival rate reached 88%.

hybrid Broussonetia papyrifera;tissue culture;rapid propagation

S792.99

A

1002-2481（2016）08-1073-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.08.05

2016-05-16

山西省普通高等学校大学生创新创业训练项目（J201482025）

刘 芸（1993-），女，河北石家庄人，在校学生，研究方向：中药材开发与应用。