高效液相色谱法测定稳心律合剂中4种丹参类成分含量

成彦，顾宁，陈伟，方丹君

(1.南京医科大学,江苏 南京 210029；2.南京市中医院，江苏 南京 210001；3.苏州市中医医院，江苏 苏州 215009)



高效液相色谱法测定稳心律合剂中4种丹参类成分含量

成彦1，2，顾宁2，陈伟3，方丹君1

(1.南京医科大学,江苏 南京 210029；2.南京市中医院，江苏 南京 210001；3.苏州市中医医院，江苏 苏州 215009)

目的 建立高效液相色谱法(HPLC)测定稳心律合剂中4种丹参类成分的含量。方法 采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温35 ℃，流动相A为乙腈，流动相B为0.03 mol·L-1乙酸铵(甲酸调pH至2.4)，进行梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长280 nm。结果 4种丹参类成分(丹参素钠在15.41～154.1 mg·L-1；原儿茶醛在4.79～47.9 mg·L-1；丹酚酸B在7.37～73.7 mg·L-1；丹参酮Ⅱa在4.22～42.2 mg·L-1浓度范围内)均呈良好线性关系(r=0.999 9)；平均回收率为95.79%～97.48%；RSD均小于3.0%。结论 该方法灵敏度高、准确性好、具有较好的重复性和稳定性，可用于稳心律合剂的质量控制。

丹参;稳心律合剂;高效液相色谱法;含量测定

稳心律合剂为南京市中医院心内科常用制剂，具有通心阳，益心气，补阴血，安神定悸的作用；已在临床使用多年，对心悸胸闷、头昏不适、快速房颤、室上速、窦性心律失常有显著的疗效。该药主要由桂枝、丹参、炙甘草、麦冬、瓜蒌、生龙骨、黄连、牡蛎、苦参等组成。稳心律合剂组方药味较多，成分比较复杂，目前对该制剂尚未制定快速有效的质量控制方法，丹参作为该制剂中的君药，为唇形科植物丹参(salviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根茎[1-3]，是我国常用传统中药，味苦，性微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦等功效。临床广泛用于心脑血管疾患[4-5]，丹参含有多种化学成分并具有广泛的生物活性，其传统药理以扩血管，活血化瘀，改善微循环为主[6-7]。现代药理研究表明，丹参尚具有抗肿瘤，抗菌消炎，抗雄性激素，抑制皮脂腺增生，抗肝硬化，抗纤维化，促进组织修复和再生等多种药理活性[8]。

高效液相色谱法(HPLC)作为现代化的检测技术[9-10]，已经比较成熟的运用在了药检中，本文运用HPLC对稳心律合剂中君药丹参中的四种成分进行检测，建立了快速稳定的质量检查方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(Waters e2695-2998，PDA检测器，Empower 3色谱工作站)；Agilent Zorbax SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；电子天平(Sartorius， BP115D，d=0.1 mg)；高速离心机(Thermo，Biofuge primo R)；电热恒温水浴锅(HH S11-6S，上海跃进医疗器械厂)。

1.2 试药及试剂 甲醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；乙腈(Sigma-Aldrich，色谱纯)；乙酸铵(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；去离子水(Milli-Q超纯水机制备，美国Millipore公司生产)。

丹参素钠对照品(批号：201412，纯度：99.5%)，原儿茶醛对照品(批号：201007，纯度：98.2%)，丹酚酸B对照品(批号：201313，纯度：97.0%)，丹参酮IIa对照品(批号：200619，纯度：100%)，均购自中国药品生物制品检定研究院。

10批稳心律合剂，批号为150119、150209、150311、150421、150529，150626、150713、150822、150918、151014均由南京市中医医院制剂部生产。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent Zorbax SB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为35 ℃，流动相A为乙腈，流动相B为0.03 mol·L-1乙酸铵(甲酸调pH至2.4)，梯度洗脱，程序见表1，流速为1.0 mL·min-1，检测波长为280 nm，进样量为10 μL。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别取丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、丹参酮IIa对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含丹参素钠0.15 mg、原儿茶醛0.05 mg、丹酚酸B 0.07 mg、丹参酮IIa 0.04 mg的混合溶液，即得对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取批号8150529稳心律合剂10 mL，水浴蒸干，用适量甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，离心，取上清液，即得。

2.2.3 空白溶液 以相应的溶剂作为空白溶液，即得。

2.3 系统适用性试验 取混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各10 μL，按“2.1”项下条件进行检测，4种丹参类成分色谱峰分离度良好，空白无干扰，色谱图见图1。原儿茶醛对照品峰的理论板数为24 174，主峰和杂质分离良好，分离度为15.1，拖尾因子1.03。

2.4 线性关系 精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，进样10 μL，按“2.1”项下条件进样，测定峰面积。分别以4种丹参成分的浓度(mg·L-1)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。将上述对照品溶液再稀释后进样，根据峰高以信噪比S/N=3确定检出下限，S/N=10确定定量下限。结果见表2。

2.5 精密度试验 取批号150529样品的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算4种成分进样精密度，丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、丹参酮IIa RSD分别为1.76%、1.22%、0.89%、1.04%，说明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取批号150529样品的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、4、6、8、12、24 h进样，测定峰面积，计算4种成分的稳定性，丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、丹参酮IIa RSD分别为1.01%、1.66%、1.32%、0.65%，说明样品在24 h内稳定。

注：1.丹参素钠；2.原儿茶醛；3.丹酚酸B；4.丹参酮IIa。

图1 HPLC色谱图

2.7 重复性试验 精密量取批号150529样品6份，每份25ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算4种成分含量，其RSD在0.79%～1.87%之间，说明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密量取已测得含量的批号150529样品6份，各10 mL，精密加入“2.2.1”项下混合对照品溶液0.5 mL，水浴蒸干，加甲醇适量，定容至10 mL，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，计算回收率和RSD，结果见表3。

表3 4种重楼皂苷加样回收率(n=6)

2.9 样品测定 取稳心律合剂10批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定4种成分含量，结果见表4。

表4 样品含量测定/mg·L-1

3 讨论

稳心率合剂为笔者所在医院的临床常用药，主要由丹参，龙骨等中药组方而成。目前尚未制定对该制剂快速有效的质量控制方法。丹参是稳心率合剂中主要药物，选定丹参中的4种主要成分进行含量测定并建立稳定可靠的质量控制方法比较符合制剂的质量标准研究思路。

由于中药复方中成分众多，等度洗脱难以充分分离，所以采用梯度洗脱的方法。选用Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，采用梯度洗脱方法，比较了不同流动相系统乙腈-乙酸铵溶液、甲醇-水、乙腈-醋酸水溶液。结果表明，乙腈-乙酸铵溶液(0.03 mol·L-1)系统优于其他流动相系统，故选乙腈-乙酸铵溶液流动相系统作为本制剂指纹图谱流动相系统。

对样品处理方法进行比较。采用甲醇与水超声提取，比较了甲醇的不同体积分数(20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%)；比较了不同提取方法(超声、加热回流、浸渍等)、不同超声时间(5、10、15、20、30、40、50和60 min)。结果表明，甲醇优于水；对不同提取方法比较，结果表明，超声提取峰面积大、时间短；对不同超声时间比较，结果表明，甲醇超声30 min以后，丹参中4种成分各个峰的面积不增加。综合上述各因素，选择体积分数为70%甲醇、超声30 min。

对不同柱温与流速进行比较，柱温超过或低于35 ℃，色谱峰分离度小；流速高于或低于1.0 mL·min-1，色谱峰分离度差。因此选择便于控制的柱温35 ℃与流速1.0 mL·min-1。

本文建立了丹参4种成分含量测定方法，精密度、稳定性、重复性均符合要求。上述方法为制定稳心率合剂质量标准提供了理论依据。

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Content determination of 4 components of salvia in wenxinlv mixture by HPLC

CHEN Yan1,2,GU Ning2,CHEN Wei3,et al

(1.NanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210029,China;2.NanjingMunicipalHospitalofTCM,Nanjing,Jiangsu210001,China;3.SuzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine,Suzhou,Jiangsu215009,China)

Objective To establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of 4 chemical components of salvia in wenxinlv mixture.Methods HPLC system consisted of Agilent Zorbax SB C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm),gradiently eluted with acetonitrile-water solution(0.03 mol·L-1ammonium acetate).The flow rate of mobile phase was 1.0 mL·min-1,UV detection wavelength was set at 280 nm and column temperature was maintained at 35℃.Results The four components showed good linearity within the tested concentration scope(r=0.999 9);the method was validated and the recoveries were 95.79%～97.48%.RSD was lower than 3.0%.Conclusion This method is simple,accurate and reproducible,which can be used for the quality control for wenxinlv mixture.

Danshen;Wenxinlv mixture;HPLC;Content determination

江苏省中医药局科技项目(YB2015059)；南京市2015年度科技发展计划资助项目(2015YX009)；南京市中医院科研项目(YJLC201605)

方丹君，女，副教授，硕士生导师，研究方向：单细胞分析，E-mail：djf@njmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.011

2016-07-26，

2016-09-05)