磁性Fe3O4/SiO2复合粒子固定化漆酶及催化去除酚类污染物

马 丽，赵东磊，郑晓冰，贺 莹

（河北工业大学 化工学院，天津 300130）

磁性Fe3O4/SiO2复合粒子固定化漆酶及催化去除酚类污染物

马 丽，赵东磊，郑晓冰，贺 莹

（河北工业大学 化工学院，天津 300130）

利用溶胶凝胶法制备磁性 Fe3O4/SiO2复合粒子，并用 -氨丙基三乙基硅烷（3-APTES）对复合粒子进行修饰，作为固定化漆酶的载体，研究了固定化漆酶适宜的催化条件．结果发现，固定化漆酶的最佳反应温度为30℃，pH为4.5，固定化酶的酶活为180 U/g，酶活回收率为68.45%．考察了固定化漆酶的热稳定性、pH稳定性和储存稳定性，与游离酶相比，固定化漆酶更加稳定，便于连续操作．将固定化漆酶用于去除废水中的2,4-二氯酚，反应12 h，去除率最高为68.35%，该固定化酶重复重复使用12次后，对2,4-二氯酚的去除率可保持在52.85%．

磁性复合粒子；漆酶；固定化；2,4-二氯酚

漆酶（EC 1.10.3.2）是一种结合多个铜离子的多酚氧化酶[1]，广泛存在于植物、动物和微生物中，由于其在催化反应过程中能够将分子氧还原成两分子水，并同时催化各种酚类燃料、取代酚、氯酚、硫酚芳香胺等，因而日益受到人们的关注[2]．已经广泛用于纺织工业、纸浆和造纸工业、印染污水处理、食品饮料行业、生物燃料以及构建生物传感器等[3-5]．但游离态的漆酶活性和稳定性差，不能耐受高温、强酸碱等反应环境，而且难于回收重复利用，阻碍了其在工业上的大规模应用[6-7]．固定化酶技术的使用可以克服游离态漆酶的上述缺点，扩大漆酶的使用范围．固定化漆酶的方法有很多，如包埋法、吸附法、共价结合和交联等，研究表明，通过固定化后的漆酶可以保持较好的活性和稳定性[8]．目前，采用固定化漆酶的载体有：壳聚糖、硅胶、多孔玻璃、介孔二氧化硅、纳米材料等[9]，考虑到漆酶在工业使用时既要保持较高且稳定的酶活性又要便于分离、回收，所以研究以磁性复合粒子作为载体固定化漆酶．

磁性粒子是近年来功能材料的研究热点，在生物医药、传感器、生物分离以及固定化酶载体等领域有很大的应用潜力[10]，但磁性粒子易被氧化、聚集效应强、稳定性差等缺点，限制了其在生物领域的应用，为了提高酶的负载量和稳定性，需要对磁性粒子进行修饰或在表面包裹保护层，SiO2具有良好的生物相容性和化学稳定性，是包覆磁性纳米粒子的理想材料之一[11]．本文主要研究利用溶胶凝胶法与磁性纳米粒子结合制备磁性Fe3O4/SiO2复合粒子，将其作为载体用于固定化漆酶，并研究了固定化漆酶对2,4-二氯酚的去除效果．

1 实验部分

1.1 主要试剂

1.2 实验方法

1.2.1 溶胶凝胶法制备磁性Fe3O4/SiO2复合粒子及其修饰与活化

利用共沉淀法制备Fe3O4粒子[12]，将FeCl3和FeCl2以摩尔比1.8：1与HCl混合，并加入到NH3·H2O （0.7mol/L）中，剧烈搅拌混合均匀，反应30m in后，利用外加磁场进行分离，充分洗涤后分散于蒸馏水中待用．用溶胶凝胶法制备Fe3O4/SiO2复合粒子：在三口烧瓶中加入38 m L乙醇，3 m L NH3·H2O（28%），38m LH2O以及10m L预分散的Fe3O4悬浊液．将35m L TMOS与乙醇的混合液（6%（V/V））滴加到连续搅拌的三口烧瓶中，反应4 h后，利用外加磁场将产物分离，并用蒸馏水充分洗涤3次，真空冷冻干燥24 h，得到Fe3O4/SiO2复合粒子．

称取0.5g Fe3O4/SiO2复合粒子与25m L甲苯混合，20m in超声振荡后，转移到三口烧瓶中，再加入5m L 的3-APTES和25m L甲苯混合均匀，在磁力搅拌下，加热至120℃回流4 h，分离出产物，分别用丙酮和甲苯洗涤产物并离心三次，真空冷冻干燥12 h后得到氨基修饰的Fe3O4/SiO2复合粒子．

量取pH 7.0（0.2mol/L）的磷酸盐缓冲溶液和戊二醛（8%（W/V））各10m L，加入125mg氨基修饰的Fe3O4/SiO2复合粒子，置于恒温水浴摇床中，反应温度25℃，转速150 r/m in，反应时间8 h．产物用大量蒸馏水水洗涤，真空冷冻干燥，得到活化的磁性载体．

1.2.2 漆酶的固定化

分别称取20mg氨基修饰并活化的Fe3O4/SiO2复合粒子，加入9m L，pH 6.0磷酸盐缓冲溶液，再加入一定浓度的漆酶溶液，在恒温水浴摇床中，反应温度25℃，转速150 r/m in，反应时间6h．外加磁场分离固定化酶，并用pH 6.0磷酸盐缓冲溶液洗涤，4℃下保存备用．

1.2.3 漆酶酶活的测定

将2m L游离漆酶或固定化酶与6m L邻苯二酚混合（6mg/m L），放入恒温水浴摇床，在30℃，150 r/min的条件下反应30m in，在400 nm波长下测定反应液的吸光度，计算酶活[13]．

固定化酶酶活回收率=固定化酶酶活/游离酶酶活×100%．

考察温度和pH对固定化漆酶酶活的影响时，分别改变温度和pH，其他实验按上述条件进行．

1.2.4 2,4-二氯酚的去除

根据水及污水检测标准[14]，将游离漆酶、固定化漆酶及等量的载体分别与3m L 2,4-二氯酚（0.4mg/m L）混合均匀，在30℃，150 r/m in的水浴摇床中反应30m in．取出0.1m L反应液，稀释至20m L，加入一定量的氨水，利用磷酸盐缓冲溶液调节pH至7.9，再依次加入0.025 m L的六氰合铁三钾（80 g/L），0.025 m L的4-氨基安替比林（2%），反应15m in，测定其在509nm波长下的OD值，计算去除率．在重复性实验中，固定化漆酶重复使用12次，每次反应后测定其去除率，同时将固定化漆酶及载体用缓冲液充分洗涤，进行下一批次实验．

1.2.5 表征

用扫描电子显微镜（SEM，JSM-6700F，JEOL，日本）表征Fe3O4/SiO2复合粒子的形貌特征；傅立叶变换红外光谱仪（22型，Bruker，德国）测定Fe3O4/SiO2复合粒子及氨基修饰后的Fe3O4/SiO2复合粒子的红外光谱；广角X射线衍射（XRD）获得Fe3O4粒子、Fe3O4/SiO2复合粒子、氨基修饰的Fe3O4/SiO2复合粒子晶型特征峰；用磁滞回线测定仪（7407，Lakeshore，美国）及示波器等测定并导出磁性粒子Fe3O4/SiO2复合粒子的磁滞回线．

2 结果与讨论

2.1 磁性Fe3O4/SiO2复合粒子表征

2.1.1 磁性Fe3O4/SiO2复合粒子的形貌

图1为磁性Fe3O4/SiO2复合粒子的SEM图，由图1可以看出，磁性Fe3O4/SiO2复合粒子呈现球形分布，大部分复合粒子的直径在200～600 nm之间，部分粒子有团聚的现象．

图1 磁性Fe3O4/SiO2复合粒子的SEMFig.1 SEMimageof Fe3O4/SiO2magnetic composite

2.1.2 载体粒子的红外光谱分析

红外光谱分别检测磁性Fe3O4/SiO2复合粒子和功能化的磁性Fe3O4/SiO2复合粒子，图2中在574 cm1处有Fe-O键的吸收峰，Fe-O-Si的特征吸收峰应该在584 cm1处，但在红外谱图上并没有明显的吸收峰，是因为这个吸收峰与574 cm1处Fe-O键产生吸收峰重叠，在1 061 cm1处强的吸收峰是Si-OSi键对称伸缩振动吸收峰，在457 cm1和800 cm1处是Si-OSi键的弯曲振动吸收峰和摇摆振动吸收峰[15]，966 cm1和1634 cm1分别代表了弯曲振动的Si-OH键和-OH键，这些都说明SiO2已经包裹在Fe3O4粒子的表面．图2a中3000 cm1左右出现的较大吸收峰，可归属于氨基硅烷的N-H键的伸缩振动特征吸收峰，在1 547 cm1处的吸收峰是N-H键的变形振动吸收峰．通过红外谱图分析，说明氨基硅烷已经被成功修饰到磁性Fe3O4/SiO2复合粒子上．

图2 磁性Fe3O4/SiO2复合粒子红外谱图Fig.2 FT-IR spectraof Fe3O4/SiO2magnetic composite

2.1.3 磁性Fe3O4/SiO2复合粒子的XRD分析

图3为广角X射线衍射图，曲线a、b、c分别对应Fe3O4磁性粒子、磁性Fe3O4/SiO2复合粒子和氨基修饰的磁性Fe3O4/ SiO2复合粒子．图3的b和c与a相比，明显看出2 =22°处出现了一个较宽的峰，这是无定型二氧化硅的衍射峰，说明二氧化硅层已经成功包覆在磁性粒子表面．图3中a、b、c 在2=30°，35°，43°，57°，62.5°处都有衍射峰，与Fe3O4的衍射卡一致[16]，对应衍射峰位置不变，变化的只是特征峰强度和峰宽，表明二氧化硅的包覆及其氨基修饰不会改变磁性粒子的晶形．

图3 XRD衍射图谱Fig.3 XRD patterns

2.1.4 载体粒子的磁学性能分析

图4为 Fe3O4复合粒子及磁性Fe3O4/SiO2复合粒子在室温下的磁滞回线．由图4可知，磁滞回线呈可逆“S”型，Fe3O4粒子与磁性Fe3O4/SiO2复合粒子的矫顽力和剩余磁化强度接近0，说明两种载体粒子都具有超顺磁特性．但磁性Fe3O4/SiO2复合粒子的饱和磁化强度比Fe3O4粒子低，这可能是因为包裹磁性粒子的SiO2层本身不具有磁性，包裹之后复合粒子的饱和磁化强度降低．

2.2 磁性Fe3O4/SiO2复合粒子固定化漆酶的性质

20mg磁性Fe3O4/SiO2复合粒子为载体，漆酶浓度4mg/m L，交联剂戊二醛浓度为8%（V/W），固化温度25℃，固化pH 6.0，固化时间8 h的条件下，固定化漆酶的酶活为180U/g，酶活回收率为68.45%．

图5和6分别为反应温度和pH对游离酶和固定化酶的酶活影响．由图5，图6可以看出，反应温度为30℃时，pH为4.5时表现出较高的酶活，而且明显看出与游离酶相比固定化漆酶的温度、pH适用范围更大，这是因为利用磁性Fe3O4/SiO2复合粒子为载体固定化漆酶，漆酶分子与载体之间相互作用，与酶分子多位点连接，增大了酶分子的刚性，抑制了酶分子的伸展变形和非特异性聚集，天然构象不易发生改变[17]，更好的抵抗反应温度和pH变化的影响，提高了固定化酶的稳定性．

图4 磁性粒子（a）和磁性Fe3O4/SiO2复合粒子（b）的磁滞回线Fig.4 Hysteresis loop ofmagnetic particles(a)and Fe3O4/SiO2magnetic composite particles(b)

图5 温度对游离漆酶和固定化漆酶酶活的影响Fig.5 Effectof temperatureon theactivity of freeand immobilized

图6 pH值对游离漆酶和固定化漆酶酶活的影响Fig.6 EffectofpH on theactivity of freeand immobilized laccase

分别将固定化酶和游离酶放入磷酸盐缓冲溶液中（pH 4.0），4℃下保存28 d，每隔一段时间考察其相对活性（图7）．28 d后固定化酶相对活性为62.23%，而游离酶仅保留了初始活性的41.01%，表明固定化漆酶的储存稳定性要优于游离酶．这是因为漆酶在固定化后，从一定程度上保护了其天然构象，而且与载体之间的相互作用使酶分子不易从载体上脱落[18]，从而保持了较好的储存稳定性，有利于后期工业化的应用．

图7 固定化漆酶的储存稳定性Fig.7 Storagestability of immobilized laccase

2.3 固定化漆酶去除2,4-二氯酚

为了考察固定化漆酶作为生物催化剂的效果，选择2,4-二氯酚为模型物系，考察固定化酶对2,4-二氯酚的去除效果，图8为反应时间对游离酶、载体和固定化漆酶去除2,4-二氯酚去除率的影响．由图8可知，固定化漆酶的去除效果优于游离酶，反应达到8h去除率增涨不明显，基本达到平衡，12h去除率最高达到68.35%，而游离酶在长时间的反应过程中可能有因为构象变化发生部分酶的失活现象．

图9为固定化酶和载体吸附去除2,4-二氯酚的重复使用性，固定化漆酶重复使用12次后该固定化酶对2,4-二氯酚去除率降低15.50%，显示了较好的重复使用性，而且固定化漆酶可以快速和反应体系分离，能够大大提高了操作效率．

图8 反应时间对2,4-二氯酚去除的影响Fig.8 Effectof reaction timeon 2,4-dichlorophenoldegradation

图9 固定化酶去除2,4-二氯酚的重复使用Fig.9 Repeated useof immobilized enzymeon 2,4-dichlorophenol degradation

3 结论

共沉淀法制备Fe3O4粒子，通过溶胶凝胶法在其表面成功包覆SiO2后，用3-APTES对Fe3O4/SiO2复合粒子进行氨基修饰，并用于漆酶的固定化．通过SEM、红外光谱、XRD及磁力回线检测仪对Fe3O4粒子、Fe3O4/ SiO2复合粒子、氨基修饰的Fe3O4/SiO2复合粒子进行表征，制备的磁性复合粒子为球形，且具备超顺磁性，并且在粒子表面成功修饰了氨基．研究表明，固定化漆酶与游离酶相比对温度和pH的耐受范围更广，储藏稳定性好，便于连续操作，且对2,4-二氯酚具有良好的去除效果（12h去除率最高达到68.35%）重复使用12次后仍保持52.85%的去除率．磁性Fe3O4/SiO2复合粒子为载体固定化漆酶在工业催化领域具有很大的应用价值．

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[责任编辑 田 丰 夏红梅]

Immobilizationof laccaseon Fe3O4/SiO2magnetic compositeparticlesand itsapplication in phenolic pollutantsdegradation

MA Li，ZHAO Donglei，ZHENG Xiaobing，HEYing

(Schoolof Chemical Engineering,HebeiUniversity and Technology,Tianjin 300130,China)

Magnetic silica compositeparticleswere prepared by using sol-gel reaction.The composite particleswere functionalizedwith 3-Am inopropyltriethoxysilane(APTES)and used to immobilize laccase.Theeffectsofcatalytic condition wereoptim ized.The resultsshowed thatcatalytic pHwas4.5,catalytic temperaturewas30℃,thehighestspecific activity of immobilized laccase reached to 182U/gand theactivity recoverywas68.45%.Comparedwith free laccase,the thermal, pH,storage stabilitiesof the immobilized laccasewere improved significantly.The catalytic activity of the immobilized laccase was also demonstrated by the degradation of 2,4-dichlorophenol.Itwas found that the removal rate of 2,4-dichlorophenolwas68.35%in about12 hours;and after12 consecutive cycles,the removal ratewas52.85%.

magnetic composite particles;laccase;immobilization;2,4-dichlorophenol

Q814.2

A

1007-2373(2016)01-0085-05

10.14081/j.cnki.hgdxb.2016.01.016

2015-08-23

河北省科技计划项目（13273607，13274314）

马丽（1983-），女（汉族），实验师．

：赵东磊（1981-），男（满族），讲师．

数字出版日期：2016-02-27数字出版网址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/13.1208.T.20160227.1613.008.htm l