肌肽酯类衍生物脾细胞增殖活性及血浆稳定性研究*

臧 皓，徐 倩，滕 云，张海丰

(1.通化师范学院制药与食品科学学院，吉林通化134002;2.通化市通化县三棵榆树镇中心校，吉林通化134002)

肌肽酯类衍生物脾细胞增殖活性及血浆稳定性研究*

臧 皓1，徐 倩1，滕 云2，张海丰1

(1.通化师范学院制药与食品科学学院，吉林通化134002;2.通化市通化县三棵榆树镇中心校，吉林通化134002)

目的:研究肌肽酯类衍生物的脾细胞增殖活性及血浆稳定性.方法:应用小鼠的脾脏和健康人的血浆进行实验研究.结果:脾细胞增殖活性测试结果表明，在实验浓度下，大部分化合物表现出一定的脾细胞增殖活性，特别是化合物3b、3c、3d 和3e对脾细胞的增殖活性高于阳性对照ConA.血浆稳定性实验结果表明，与肌肽相比，10个化合物均具有很好的血浆稳定性.结论:化合物3b、3c、3d和3e具有良好的血浆稳定性和脾细胞增殖活性，具有深入研究的价值.

肌肽;酯类衍生物;脾细胞增殖;血浆稳定性

肌肽是一种内源性二肽，具有清除活性氧和活性氮的功能，同时还具有螯合金属离子作用，可以清除脂质自氧化产生的α，β－不饱和醛［1－2］，肌肽还可以保护蛋白免于非酶糖化反应［3－4］.近年来，研究发现肌肽还具有抗肿瘤、治疗白内障、糖尿病肾病和阿尔茨海默病、肝脏疾病和眼科疾病等多种药理作用.而且肌肽性质温和，几乎没有毒副作用，在医药领域具有广阔的应用前景.然而，血浆中的肌肽酶能迅速把肌肽水解生成β－丙氨酸和L－组氨酸，阻止肌肽发挥治疗作用，因此，对肌肽进行结构修饰、得到血浆稳定性好、活性高的化合物一直是研究的热点，本实验主要研究肌肽酯类衍生物3a－3j是否具有脾细胞增殖作用及良好的血浆稳定性.

1 实验材料

1.1 药品

肌肽酯类衍生物3a－3j按照之前的方法［5］制备，它们是对肌肽羧基位点进行结构修饰，与醇进行酯化反应得到的，结构见图1.

1.2 试剂与仪器

图1 肌肽酯类衍生物的结构式

25～40岁健康成年人的血浆(长春市中心血站)，胎牛血清(美国Gibco公司)，RPMI 1640(美国Gibco公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司)，青霉素钠(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，硫酸链霉素(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)，WST－1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(北京东方德教育科技有限公司)，2010型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，BIO－RAD－680型酶标仪(美国Bio－Rad公司);Heraeus HERAcell 150i二氧化碳培养箱(日本三洋公司).

2 生物活性实验

2.1 脾细胞增殖活性

将2只小鼠麻醉后脱椎处死，浸泡于体积分数为75%的乙醇溶液中约10min，将脾取出放在已灭菌的培养皿中，加入5mL胎牛血清(FBS)/1640完全培养基，将脾剪碎，用3～4层纱布过滤，收集滤液，以转速1000 r/min离心10min，弃去上清液.加入10mL完全培养基，吹打成均匀的悬浮细胞，用含体积分数为10%体积分数的FBS/1640培养液将细胞密度调至106个/mL，以100μL/孔将细胞悬浮液接种于96孔板，实验组样品浓度分为高中低三种浓度，分别为20μg/mL、100μg/mL、500μg/mL.每孔接种100μL/孔，空白对照每孔接种100μL的1640培养基，阳性对照组每孔接种20μL浓度为5μg/mL的伴刀豆蛋白(ConA)，每组设3个复孔.置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱内培养2d，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养4h，以转速1000 r/min离心10min，将96孔板倾斜30o，小心吸去上清液.每孔加入100μL的二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，用酶标仪于490nm测定吸光值，按照下式计算增殖率，结果列于表1.

细胞增殖率(%)=［(给药组A490nm-空白对照组A490nm)/空白对照组A490nm］×100%

表1 化合物3a－3j的脾细胞增殖活性评价

2.2 血浆稳定性实验

采用25～40岁成年人的血浆，底物的浓度为1.5mmol/L，用pH=7.4的磷酸缓冲盐配制，血浆未经稀释直接与等体积底物混合，于37℃孵化2h，每30min取样1次，用血浆2倍体积的冷乙腈终止反应，立即混合后以转速12000 r/min离心10min，用0.45μm的有机滤膜过滤后直接注入液相色谱仪测试，根据底物峰面积减少计算其水解程度.

根据时间对肌肽的含量作图得到图2，可得肌肽的降解方程:y=－0.059x+0.9936，R2= 0.9983，可见肌肽的水解成线性由方程得到肌肽的血浆半衰期t1/2=8.37min.其他化合物的实验结果见表2.

图2 肌肽血浆稳定性的标准曲线

表2 化合物3a－3j的血浆稳定性评价

3 结果与讨论

从表1可以看出，肌肽酯类衍生物在三种浓度下都有增殖脾细胞的作用，但不是呈线性分布，增殖率最高的往往出现在低浓度组和中浓度组，这表明化合物的浓度对脾细胞的增殖率影响很大，合适的浓度设置是实验成败的关键.实验结果表明，肌肽并没有显示出脾细胞增殖作用，相反还有轻微的抑制作用.化合物3b的低浓度组增殖率为123.2%，中浓度组为95.6%，均超过阳性对照组，高浓度组增殖率为67.8%，也与阳性对照组非常接近，说明3b在低浓度时即对脾细胞有很好的增殖作用;化合物3c在中浓度时的增殖率为70.5%，也超过阳性对照组，说明3c在中浓度时对脾细胞有不错的增殖效果;化合物3d在低浓度组增殖率为93.8%，也超过阳性对照组，显示了很好的增殖作用;化合物3e在高浓度组增殖率为69.5%，也略高于阳性对照组，其余的肌肽酯类衍生物均具有中等强度的脾细胞增殖作用.这说明通过对肌肽羧基结构修饰成酯基可以增加肌肽对脾细胞增殖作用，使肌肽衍生物具有新的药理活性.

通过研究发现，脾细胞增殖活性高于阳性对照组的四个化合物3b－3e的碳链长度为2～4之间，过长或过短都使增殖活性降低，为以后设计合成肌肽酯类衍生物的碳链长度提供依据.通过实验数据发现肌肽并没有显示出脾细胞增殖作用，相反，还有轻微的抑制作用.虽然有文献［6］显示服用肌肽可以使应激小鼠脾细胞的个数不下降，但并未得出肌肽可以使脾细胞增殖的结论，可能肌肽在体内是通过其他途径发挥的作用.而肌肽酯类衍生物对脾细胞增殖活性很好，且有4个化合物的增殖率超过阳性对照组，由此证明:肌肽酯类衍生物具有有丝分裂原的作用，具有较强的提高免疫力的作用，这4个化合物具有进一步研究的价值.

从血浆稳定性实验数据来看，通过对肌肽的结构修饰，极大地提高了肌肽衍生物的血浆稳定性.肌肽的半衰期仅为8.37min，而修饰得到的化合物2h的水解率均未超过5%，与肌肽相比，它们的水解很缓慢，血浆中的相对稳定可以保证它们温和地水解成肌肽，使肌肽达到治疗浓度从而发挥治疗作用.与肌肽酰胺类衍生物相比［7］，肌肽酯类衍生物的血浆稳定性相对差一些，因为血浆中存在酯酶，它们会使酯键断裂从而得到肌肽，肌肽再被肌肽酶水解得到L－组氨酸和β－丙氨酸，而酰胺键在这些酶的存在下相对稳定，不易水解成肌肽，这也阻止肌肽酰胺类衍生物发挥药理作用.通过稳定性实验发现，肌肽的不稳定基团是肽键，它是肌肽酶主要的识别位点，通过对肌肽的羧基修饰成酯，改变了肌肽的结构，增加了肽键附近的空间位阻，使血浆中的肌肽酶无法识别出结合位点从而提高了化合物的血浆稳定性.血浆稳定性是化合物成药性的关键一环，它决定候选化合物是否有机会成为药物，肌肽是一个多功能的化合物，有着许多重要的药理活性，但阻止其成为药物的关键因素就是血浆稳定性差，半衰期短，通过结构修饰极大地提高了其血浆稳定性，使其成药性的几率大大增加，离开发成为药物更近了一步.

综上，化合物3b、3c、3d和3e具有良好的血浆稳定性和脾细胞增殖活性，具有深入研究的价值.

［1］Aldini G，Carini M，Beretta G，et al.Carnosine is a quencher of 4－hydroxy－nonenal:through what mechanism of reaction［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，298(5):699－706.

［2］Carini M，Aldini G，Beretta G，et al.Acrolein－sequestering ability of endogenous dipeptides:characterization of carnosine and homocarnosine/acrolein adducts by electrospray ionization tandem mass spectrometry［J］.J Mass Spectrom，2003，38(9):996－1006.

［3］Hobart LJ，Seibel I，Yeargans GS，et al.Anti－crosslinking properties of carnosine:significance of histidine［J］.Life Sci，2004，75 (11):1379－1389.

［4］Szwergold BS.Carnosine and anserine act as effective transglycating agents in decomposition of aldose－derived Schiff bases［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，336(1):36－41.

［5］臧皓，李晓东，黄晓光，等.肌肽酯类衍生物的合成与生物活性评价［J］.中国药物化学杂志，2014，24(5):364－369.

［6］Li YF，He RR，Tsoi B，et al.Anti－stress effects of carnosine on restraint－evoked immunocompromise in mice through spleen lymphocyte number maintenance［J］.PLoS One，2012，7(4):e33190.

［7］臧皓，孙佳明，黄晓光，等.N－取代肌肽酰胺类衍生物的的合成及生物活性［J］.高等学校化学学报，2014，35(12):2567－ 2573.

(责任编辑:王海波)

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1008－7974(2016)06－0060－03

10.13877/j.cnki.cn22－1284.2016.12.019

2016－08－26

吉林省教育厅项目“基于UPLC－Q－TOF－MS的代谢组学技术研究草苁蓉抗衰老的作用机理”(吉教科合字［2013］第399号)

臧皓，吉林长春人，博士研究生，讲师.

张海丰，博士研究生，副教授.Email:dragon1976999@163.com